[发明专利]一种用于鳜鱼虹彩病的卵黄抗体冻干剂的制备方法

权利要求书

1.一种用于鳜鱼虹彩病的卵黄抗体冻干剂的制备方法，其特征在于：该冻干剂有效组分及其重量份数比为：羧甲基茯苓多糖30-50份、蔗糖10-30份、蜂胶2-5份、甘氨酸1-5份、聚乙烯吡咯烷酮1-2份、维生素C 0.5-1份、大豆蛋白胨1-5份。

2.一种如权利要求1所述的一种用于鳜鱼虹彩病的卵黄抗体冻干剂的制备方法，其特征在于：该制备方法的步骤为：

(1)按照重量配比分别称取羧甲基茯苓多糖、蔗糖、蜂胶、甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、维生素C、大豆蛋白胨，溶于45-65℃蒸馏水中得溶液A；

(2)将步骤(1)中溶液A在120℃下高压灭菌15-30分钟，2-8℃保存，得冻干剂；

(3)步骤(2)中所得冻干剂与用于鳜鱼虹彩病卵黄抗体溶液比为按体积比1：5-1：9充分混匀，冻干处理，即得本发明一种用于鳜鱼虹彩病的卵黄抗体冻干剂。

3.根据权利要求2所述的一种用于鳜鱼虹彩病的卵黄抗体冻干剂的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述鳜鱼虹彩病的卵黄抗体的制备方法的步骤为：

(1)免疫原抗原的制备

病毒的增殖：将鳜鱼虹彩病毒毒株用灭菌生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml，经尿囊腔接种10-11日龄鸭胚，每胚0.1-0.2ml，置37℃孵育24小时，照胚弃去24小时内的死胚；对接种24小时后的鸭胚，每4小时照胚一次，将死亡胚放2-8℃冰箱；收集24-120小时死亡鸭胚的尿囊液及胚体，匀浆后，反复冻融2次，再以4200r/min离心20-30分钟，收集上清液，分别定量分装于无菌安培瓶中，注明收获日期、毒种代次，冷冻保存备用；

接种：用灭菌生理盐水将增殖所得病毒毒种稀释103-105倍，经尿囊腔接种10-11日龄易感鸭胚，每胚0.1-0.2ml，封孔后，置36-37℃继续孵育120小时，不必翻蛋；

孵育：接种后24小时开始照胚，弃去24小时内的死胚，之后每4小时照胚一次，24-120小时死亡的鸭胚随时取出，置于2-8℃冷却12-24小时；

收获：将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集鸭胚的尿囊液和胚胎，收集时逐个检查胚胎病变，凡胚胎腐败、胚液浑浊或胚胎无病毒所引起的特征性病变者，弃去不用；毒种的5-8枚鸭胚的尿囊液和胚胎混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，分别取病毒上清液置于灭菌容器内，记为鳜鱼虹彩病毒病毒液，均置于-20℃保存备用。

病毒液灭活：将病毒液分别加入10％的甲醛溶液，随加随摇使其充分混合，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃条件下灭活24小时，期间每4小时摇晃一次，灭活完毕，灭活后的病毒液D置2～8℃保存，有效期为30日；

(2)高免蛋生产与收集

高免蛋的生产：选择健康的未经免疫的产蛋鸡，用步骤(1)中配比后鱼虹彩病毒病毒液D对鸡群进行产蛋前免疫，包括基础免疫、加强免疫、强化免疫；

高免蛋收集：强化免疫接种后，从第14日开始，每隔3日抽样高免蛋，按蛋黄与灭菌生理盐水1:3(v/v)稀释，加入与原蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振摇，离心分离上清液，即为待测样品E，当病毒毒株抗体效价达到一定数值，即为高免蛋最佳收集时间，且收集的高免蛋于10～15℃环境中，放置时间应不超过10日；

(3)卵黄抗体的制备

蛋壳消毒：清洗干净步骤(2)中收集的高免蛋，然后将其浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干后，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟；

蛋黄分离：采取手工打蛋或机械打蛋，打蛋时应充分取出蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄；将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60-65℃保温(灭活)30分钟；

酸化萃取：向无菌的酸化罐中先加入蛋黄体积6倍的酸化用水(预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，pH值5.0，冷却至4℃)；然后，倒入蛋黄分离并灭活后的蛋黄液、边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2-4小时；酸化完成后，离心取上清液，然后向上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，搅拌，室温放置2-6小时；

浓缩：将加辛酸处理好的卵黄液用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤，再用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3-4倍，用NaOH调整浓缩液PH值至6.8-7.2，用0.45μm和0.22μm筒式滤芯进行过滤除菌后，按终浓度为0.1％加入甲醛溶液，充分搅拌均匀，密闭灭活2小时后定量分装，加盖密封，2-8℃保存，即得鳜鱼虹彩病的卵黄抗体。