[发明专利]乳糖的酶促己糖胺化

说明书

本发明涉及使用来自GH20己糖胺酶家族的糖苷酶生成人乳低聚糖(HMO)核心结构的方法。具体地，本发明提供通过葡萄糖胺‑恶唑啉和/或乳‑N‑二糖‑恶唑啉与乳糖反应生成乳‑N‑三糖II(LNT II)和/或乳‑N‑三糖(LNT)的方法，所述反应由根据Carbohydrate‑Active‑Enzymes(CAZy)数据库分类的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶催化。鉴定了特定的优化的酶以催化所述反应。

本发明涉及使用来自GH20己糖胺酶家族的糖苷酶生成人乳低聚糖(HMO)核心结构的方法。具体地，本发明提供通过葡萄糖胺-恶唑啉和/或乳-N-二糖-恶唑啉与乳糖反应生成乳-N-三糖(lacto-N-triose)II(LNT II)和/或乳-N-三糖(lacto-N-tetraose，LNT)的方法，所述反应由根据Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)数据库分类的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶催化。鉴定了特定的优化的酶以催化反应。此外，本发明还涉及糖苷水解酶家族20(GH20)的酶用于生产乳-N-三糖II或乳-N-四糖(LNT)的应用。

不同内切糖苷酶(如Endo M、Endo A、几丁质酶)应用于合成N连接寡糖核心三糖Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc和其衍生物，使用对应的二糖恶唑啉作为供体底物。^1,2在几丁质酶催化反应中仅以32％收率(6.4mM)从二糖恶唑啉获得N连接寡糖核心三糖Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc，尽管使用了大幅过量的受体底物(32倍)和20％的丙酮(v/v)。²人工几丁质和其他糖胺聚糖衍生物通过经修饰的二糖恶唑啉聚合来合成，使用GH18家族几丁质酶和GH56家族透明质酸酶作为催化剂。³还描述了用Endo A的二糖恶唑啉聚合。

己糖胺酶是水解酶，通常转糖基活性非常低。为了解决水解问题并提供有吸引力的收率，来自不同糖苷水解酶家族的酶进行突变以提高转糖基活性并且降低或抑制水解。然而，当优化糖苷水解酶的特定活性时，也需要鉴定转糖基的适当供体-底物和反应条件以实现高收率。

来自两歧双歧杆菌(B.bifidum)JCM1254的己糖胺酶BbhI(β-N-乙酰己糖胺酶)和LnbB(乳-N-二糖苷酶(lacto-N-biosidase))是根据Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)数据库分类的糖苷水解酶家族20(GH20)成员。Carbohydrate-Active-Enzymes数据库可获自http://www.cazy.org，采用2018年11月20日更新的版本(Lombard,V.；GolacondaRamulu,H.；Drula,E.；Coutinho,P.M.；Henrissat,B.,The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)，收录于,Nucleic Acids Res.,2014,42(D1),D490-D495.)。用于自动糖类活性酶注释(dbCAN)的数据库提供注释数据，其基于来自CAZy数据库的家族分类产生(http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/index.php,Yin Y,Mao X,Yang JC,Chen X,Mao F和Xu Y,dbCAN:a web resource for automated carbohydrate-activeenzyme annotation,Nucleic Acids Res.2012年7月；40(Web Server issue):W445-51)。生成LNT II和LNT的糖基化如方案1所示。最近，Xiao和同事证明LNT II以中等收率(37％)通过使用野生型BbhI的转糖基进行生物催化合成。⁵然而，尽管有密集的反应优化(底物浓度、有机溶剂浓度、pH、温度)，最大收率受到强烈破坏，这归因于低供体与受体之比且归因于LNT II的次级水解。LnbB还显示转糖基活性，但仅以极低收率(4％)获得LNT。⁶其他研究人员尝试通过向GH20己糖胺酶引入某些突变用来自N,N-二乙酰基壳二糖的N-Ac-葡萄糖胺进行乳糖的转糖基化，但仅使得LNT II收率从0.5％增加到5％，而LNT II维持受污染，有至少2种同分异构的三糖。⁷