[发明专利]乳糖的酶促己糖胺化

权利要求书

1.用于生成乳-N-三糖II和/或乳-N-四糖的方法，所述方法包括步骤：

(i)使葡萄糖胺-恶唑啉和/或乳-N-二糖-恶唑啉与乳糖反应，由根据Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)数据库(http://www.cazy.org,2018年11月20日更新)分类的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶催化，以获得乳-N-三糖II和/或乳-N-四糖。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)在水性溶液中进行，所述水性溶液含有至少50g/L乳糖，优选至少100g/L乳糖，尤其优选至少150g/L乳糖，最优选至少190g/L乳糖。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法在没有或基本没有有机溶剂的条件下进行。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖胺-恶唑啉和/或乳-N-二糖-恶唑啉在至少20分钟、优选至少60分钟的时期内分别添加到乳糖及所述糖苷水解酶家族20(GH20)的酶。

5.如权利要求1-4中任一项所述的生成乳-N-三糖II的方法，其中所述糖苷水解酶家族20(GH20)的酶是β-N-乙酰己糖胺酶，优选两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的β-N-乙酰己糖胺酶，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(BbhI，GenBank登录号:AB504521.1)，或与SEQ ID NO:1具有至少70％的氨基酸序列相同性且具有β-N-乙酰己糖胺酶活性的酶，或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的β-N-乙酰己糖胺酶，或包含与SEQ ID NO:2具有至少70％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列的β-N-乙酰己糖胺酶。

6.如权利要求1-4中任一项所述的生成乳-N-四糖的方法，其中所述糖苷水解酶家族20(GH20)的酶是乳-N-二糖苷酶，优选两歧双歧杆菌JCM1254的乳-N-二糖苷酶，其具有SEQ IDNO:3的氨基酸序列(LnbB，GenBank登录号:EU281545.1)，或与SEQ ID NO:3具有至少70％的氨基酸序列相同性且具有乳-N-二糖苷酶活性的酶，或包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的乳-N-二糖苷酶，或包含与SEQ ID NO:4具有至少70％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列的乳-N-二糖苷酶。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括步骤：

(ii)使所述糖苷水解酶家族20(GH20)的酶失活。

8.如权利要求1-5或7中任一项所述的生成乳-N-三糖II的方法，其中所述方法还包括步骤：

(iii)向步骤(i)的混合物或优选步骤(ii)的混合物加入β-半乳糖苷酶或半乳糖基转移酶及UDP-半乳糖，并且任选地，进一步加入乳糖以获得乳-N-四糖或乳-N-新四糖。

9.根据Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)数据库(http://www.cazy.org,2018年11月20日更新)分类的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶用于从乳糖生产乳-N-三糖II或乳-N-四糖的应用，优选权利要求5所定义的酶用于生产乳-N-三糖II的应用或权利要求6所定义的酶用于生产乳-N-四糖的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中使用葡萄糖胺-恶唑啉和/或乳-N-二糖-恶唑啉作为底物。

11.如权利要求9或10所述的应用，其中所述糖苷水解酶家族20(GH20)的酶用于权利要求1-8中任一项所述的方法。