[发明专利]蛋白酶变体及其用途

说明书

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶的变体，其具有畸枝霉属蛋白酶的丝氨酸蛋白酶活性。还公开了分离的核酸分子，其包含编码真菌丝氨酸蛋白酶变体多核苷酸序列、编码所述蛋白酶变体的核酸序列。还公开了宿主细胞和生产具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法。所述蛋白酶变体可用作适用于去污剂组合物和酶制剂，用于处理纤维、羊毛、毛发、皮革或丝绸、用于处理食品或饲料、或用于涉及蛋白质材料的修饰、降解或去除中的任何应用。

技术领域

本发明涉及丝氨酸蛋白酶的变体，尤其涉及可用于各种应用，特别是去污剂中的真菌丝氨酸蛋白酶的变体。本发明进一步涉及编码所述酶变体的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶变体的宿主细胞、包含所述酶变体的酶组合物以及制备此类组合物的方法。本发明还涉及所述酶变体和包含所述酶变体的组合物的各种用途。

背景技术

微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，可应用于各种工业领域，例如去污剂、食品、皮革、药物、诊断、废物管理和银回收。微生物胞外蛋白酶占全球工业酶总销售额的主要部分(Cherry和Fidantsef，2003)。大约90％的商业蛋白酶是去污剂酶(Gupta等，2002)。当前使用的商业去污剂制剂包含源自芽孢杆菌属(Bacillus)物种的枯草杆菌蛋白酶家族或枯草杆菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)的天然存在的碱性丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)，或者是其重组蛋白酶制剂(Maurer,2004)。

商业蛋白酶的实例例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg枯草杆菌蛋白酶309枯草杆菌蛋白酶147和冷洗蛋白酶(Novozymes A/S,DK)、Ox、Prime和(Genencor Int.,Inc.，美国)，以及BLAP S和X系列(德国，汉高)。

在液体去污剂中使用蛋白酶的主要问题是它们对去污剂中其他酶的不稳定性和蛋白水解活性。在液体去污剂中，酶与水和离液剂(如阴离子表面活性剂和络合剂)直接接触，这会导致不可逆的变性。蛋白酶降解蛋白质包括其自身和去污剂制剂中的其他酶。表面活性剂和热量增强了自动蛋白水解。因此，酶在含有蛋白酶的液体去污剂中的稳定性代表了产品开发的主要挑战(Maurer，2010)。已使用多种方法来提高工业丝氨酸蛋白酶的稳定性。基于源自同源蛋白质之间的晶体结构和序列相似性比较的信息，可以设计具有改进稳定性和/或改进性能的变体。已经通过定点和/或随机诱变开发了具有改进的催化效率和/或对温度、氧化剂和不同洗涤条件的更好稳定性以及改进的在液体去污剂中的储存稳定性的天然丝氨酸蛋白酶的变体。蛋白酶通过现有技术已知的方法有意地或随机地修饰并且被优化以用于例如去污剂和清洁剂中。这些包括点诱变、缺失或插入诱变，或与其他蛋白质或蛋白质部分的融合。一些蛋白酶的优化变体是现有技术已知的。优化变体尤其是枯草杆菌蛋白酶的已知变体。例如，申请WO199523221描述了在其他突变体中，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)DSM 5483的枯草杆菌蛋白酶中的突变，申请WO2011032988、WO2011141358、WO2012080201和WO2012080202描述了基于芽孢杆菌DSM 5483的枯草杆菌酶，当使用这种突变时，提高蛋白酶性能以及减少蛋白酶和其他分子的损伤。