[发明专利]沉淀植酸酶的方法

说明书

本文公开了一种将植酸酶作为与聚阴离子的复合物有效沉淀的方法，以及包含植酸酶和聚阴离子的组合物和制造此类组合物的方法。

技术领域

本发明涉及蛋白质生产领域，具体来说涉及植酸酶的浓缩和包含植酸酶的组合物。

背景技术

植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶；EC 3.1.3.8和3.1.3.26)是在植物、特别是谷类和油料作物种子中发现的一类催化植酸(在盐形式下为肌醇六磷酸盐、也被称为肌醇多磷酸盐，或植酸盐)的水解的磷酸酶。大多数(50-70％)膳食磷酸盐与植酸结合，对于非反刍动物来说可利用性低。

植酸酶能够降解植酸盐(肌醇六磷酸盐)，导致无机磷的释放。同时，也释放出与所述植酸盐结合的化合物。因此，通过从植酸盐释放无机磷酸盐和其他营养物，植酸酶可用于提高饲料的营养价值。在动物饲养中，用植酸酶增补饲料也有助于降低养殖的环境冲击，因为植酸盐结合的磷可以被动物利用，这减少了需添加的无机磷的量以及磷向粪肥的排泄。

大多数可商购的植酸酶是组氨酸磷酸酶(HAP)。在它们主要的第一个水解的磷位置(通常是指D-构型的分子)的基础上，它们被进一步分类为6-植酸酶(主要是引发植酸在6’位处脱磷酸化的细菌植酸酶)和3-植酸酶(主要是引发植酸在3’位处脱磷酸化的真菌植酸酶)。

蛋白质沉淀通常用于生物产物的下游处理中，以便从各种不同杂质中浓缩并纯化蛋白质。蛋白质沉淀是通过添加特定试剂以改变蛋白质溶解性，从而使蛋白质作为固体与溶液分离的过程。通过所述试剂操控蛋白质之间的排斥静电力，以利于亚显微尺寸的蛋白质聚集体的产生。所述聚集体生长并彼此粘附，最终形成缺乏良序结构的微观无定形沉淀物粒子，或者在特殊情况下形成具有良序结构的结晶粒子。如果固体浓度足够高，则这些粒子可以作为例如液体中的雾度、浊度、絮凝物或沉积物用肉眼看到。

发明内容

本发明人已令人吃惊地发现，植酸酶可以通过适用于植酸酶的大规模生产的简单方法来沉淀。所述方法可用于例如从用过的发酵液沉淀和浓缩植酸酶，并将植酸酶与所述用过的发酵液中存在的其他组分分离开。此外，所述方法可应用于制造浓缩的植酸酶组合物。通过本发明的方法形成的植酸酶-聚阴离子复合物是稳定的，使得可以例如清洗所述植酸酶-聚阴离子复合物。在沉淀后，也可以将所述植酸酶-聚阴离子复合物配制成各种不同制剂。所述沉淀物还可以在选定条件下重构成液体产物。

根据本发明的第一方面，提供了一种沉淀植酸酶的方法，所述方法包括：

i.提供包含植酸酶的水性介质；和

ii.添加聚阴离子。

本发明的方法非常快速、廉价且有效，并且它解决了与涉及超滤或其他纯化步骤以提高植酸酶浓度的以前方法相关的问题。因此，本发明简化了植酸酶组合物的生产。

不受任何特定理论限制，本发明是基于下述发现，即植酸酶能够与聚阴离子形成复合物，引起植酸酶的受控且有效的沉淀。所述复合物的形成可以通过选择诸如浓度、聚阴离子的类型、离子强度和pH的条件来控制。通过例如从用过的发酵液沉淀植酸酶并使其他组分保持可溶形式，本发明可用于生产含植酸酶的产物。所述沉淀的植酸酶-聚阴离子复合物是稳定的，允许例如浓缩和清洗以进一步提高纯度而不显著降低得率。有利的是，使用本发明的方法沉淀的植酸酶-聚阴离子复合物在以出色的得率沉淀后也可以被溶解。此外，所述沉淀物提供了非常稳定形式的植酸酶，并且甚至允许脱水和重构而不显著改变比活性或得率。

根据本发明的第二方面，提供了一种制备植酸酶组合物的方法，所述方法包括：

i.提供包含植酸酶的水性介质；

ii.添加聚阴离子，以将植酸酶作为植酸酶和聚阴离子的复合物沉淀；和

iii.回收所述沉淀的植酸酶，以获得所述植酸酶组合物。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备植酸酶组合物的方法，所述方法包括：