[发明专利]从奶、初乳和酸乳清或甜乳清中制备高纯度乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法

说明书

一种从一来源物质中制备包含乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的馏分的方法所述来源物质含有这些蛋白中至少一种，其中该来源选物质自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，通过具有阳离子交换特性的整体柱的色谱分离工艺，其中在分离工艺中，在将来源物质上样到该柱后采用pH梯度或pH和盐梯度联合洗脱。进一步公开的是一种物质组合，其包括C值＞60％、A值＞1％的乳铁蛋白或乳过氧化物酶。

本发明涉及一种从含有这些蛋白质中至少一种的来源物质制备包含乳铁蛋白或乳过氧化物酶的馏分的方法，以及高纯度的乳铁蛋白或乳过氧化物酶蛋白质。

背景技术

乳铁蛋白(LF)和乳过氧化物酶(LPO)是存在于奶、乳清和初乳中的功能性小蛋白。LF是一种80kDa的糖基化蛋白，可以对各种生理和环境变化作出反应，因此被认为是宿主第一道防线的关键成分。除了所有转铁蛋白共有的Fe³⁺自身稳态平衡功能外，LF的结构特点还提供了以下功能：针对广谱的细菌、真菌、酵母、病毒和寄生虫具有很强的抗菌活性；抗炎和抗致癌活性；以及一些酶的功能[1]。LPO在保护哺乳期乳腺和新生儿肠道免受病原微生物侵害方面发挥着重要作用，参与各种致癌物的降解和保护动物细胞免受过氧化作用的影响[2]。

LF能够与铁结合。天然LF包括15-20％的含铁(Holo)LF，其中含有铁。剩下的部分是不含铁(apo)LF，它不含铁[32]。从理论上讲，apoLF的铁饱和度相当低(已经结合的铁-A值)。apoLF的理论A值约为3％。此外，apoLF拥有较高的铁结合潜力(铁容量-C值)。apoLF的C值约为50％。高纯度和非变性的apoLF有可能具有更高的C值，＞70％。另一方面，holoLF拥有高A值(50％)和低C值(10％)。分离的LF的C值越高，LF的铁结合潜力就越高。较高的铁结合潜力会导致较高的抗菌活性，因为活性LF会去除微生物生长所需的基本铁。

目前，LF和LPO是通过许多不同的技术从奶和奶加工副产品(如乳清)中分离出来的，例如：(I)用带有肝素配体的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)顺磁颗粒分离[3]，(II)通过使用阳离子表面活性剂(例如，十六烷基二甲基溴化铵)[4]，(III)不同的色谱技术(例如，阳离子交换或亲和色谱)[1,2,5-10]以及(IV)其他技术(例如，疏水离子液体[11])。一般来说，色谱技术，最重要的是离子交换色谱，代表了一种如何以相对较低的成本快速分离LF的方法[12]。色谱方法也因其稳健性和可重复性而优于其他方法。在LF和LPO的色谱纯化中最常见的技术是使用强阳离子交换树脂颗粒和膜或整体柱[13-15]。

目前的色谱法存在着一些缺点。(I)由于孔隙中的扩散传质，随着流速的增加，色谱峰会变宽，所以当流速增加时，为了获得相同的分辨率，梯度斜率必须变浅；(II)流量增加会减少色谱步骤的时间，但同时会增加洗脱量；(III)柱子长度会导致高柱压降，这是流速的一个限制因素。

在色谱纯化步骤中，奶或乳清中的LF和LPO在一定条件下与强阳离子交换剂的表面结合，然后用高pH值或高盐浓度的缓冲液收集洗脱部分。为了简化分离过程，LF和LPO最常使用几种高离子强度或pH9的缓冲溶液的阶梯(step)模式进行洗脱。这种方法通常会在一个色谱步骤中产生相对较高纯度(60-95％)的所需蛋白质馏分。为了去盐、浓缩和提高纯度，通常会引入超滤过程，以消除少量低分子量的杂质。获得的浓缩蛋白通常通过冻干或喷雾干燥进行干燥。Wang等人[18]表明，冻干的LF比喷雾干燥的(≈5％)含有更少的水(约2-3％)，相反，喷雾干燥的LF显示出稍低的变性程度和高出6-7％抗氧化活性，这与新鲜液体LF接近。喷雾干燥[1]无疑可用于生产具有完整分子构型和高抗氧化能力的无定形LF粉末。

EP0418704A1[19]描述了使用离子交换色谱柱分离、纯化和回收能够结合铁的奶蛋白的过程，该色谱柱含有表面有磺酸基的树脂颗粒。LF是通过pH/电导率阶梯洗脱模式分离的，据称最终产品的纯度大于90％。同时，需要一个超滤过程来消除少量的低分子量杂质，最终使LPO和LF的纯度达到90％或更高。