[发明专利]重组细小病毒载体及其制备方法和用途

说明书

一种带有具有共价封闭端的病毒基因组的细小病毒载体(ccePV载体)，产生所述载体的方法和用于产生所述载体的DNA构建体。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月2日提交的美国临时申请号62/755,144的优先权，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及重组病毒载体，特别是涉及带有病毒基因组的细小病毒载体，所述病毒基因组具有带有共价封闭端的双链区域。

发明内容

本申请描述了带有具有共价封闭端的病毒基因组的细小病毒载体(ccePV载体)，产生所述载体的方法和用于产生所述载体的DNA构建体。所述载体和方法适用于所有基因转移/疗法应用，例如需要递送重组基因表达盒的那些。ccePV载体高度灵活，用户友好，并且能够容易地进行修改(通过常规的DNA克隆)，并用于(通过标准的PV载体或AAV载体技术)各种应用。

附图说明

图1，分图(A)显示了常规重组AAV(rAAV)载体质粒，其用于产生具有侧接编码感兴趣基因(GOI)的表达盒的野生型ITR的单链AAV基因组。分图(B)中的单链AAV基因组包装在AAV颗粒中。分图(C)显示了常规自互补AAV(scAAV)载体质粒，其用于产生由分图(D)(左侧)中所示的单链前体形成的双链scAAV基因组，所述单链前体通过在mITR任一侧的自互补序列而自身退火或折回。在这种情况下，单链载体基因组在任一端都包括野生型ITR(wtITR)。包装在病毒颗粒中的载体基因组显示在分图(D)的右侧，说明了互补区的退火以形成所示的双链scAAV基因组。分图(A)和(C)中的两种质粒能够在细菌宿主中稳定生长。

图2显示了来自不同的经包装的AAV模板的转基因表达的途径。分图(A)显示了从单链重组AAV(rAAV)DNA的第二链合成以形成用于转基因表达的双链DNA模板；分图(B)显示了包含在3’端具有共价封闭端(CCE)结构域的双重体(duplex)DNA的scAAV，所述双重体能够促进转基因的转录，而无需分图(A)中所示的中间第二链合成步骤。分图(C)显示了具有完全互补的基因组的cceAAV-ZL，所述基因组包括不是mTR或shDNA的CCE结构域。在分图(C)中，CCE结构域通常包括几个核苷酸(2至5个核苷酸)的ssDNA区，以允许形成稳定的茎结构。与scAAV相比，分图(C)中所显示的cceAAV-ZL不需要mTR或shDNA。与在其他方面相同的scAAV载体相比，这允许cceAAV-ZL中提高的包装容量。

图3，分图(A)显示了包含单链(ss)DNA的长非互补区域的cceAAV的实施方式。分图(B)显示了在互补的双链区域内包含单链环区域(或凸起区域)的cceAAV的另一个实施方式。非互补ssDNA可以包括任何DNA序列，例如编码适体/脱氧核酶的序列、编码多肽的序列、编码siRNA的序列、编码miRNA的序列、编码shRNA的序列、聚腺苷酸化信号、绝缘子序列等。适体可以通过其与邻近的侧接互补DNA序列的连接/附着来稳定。cceAAV-LS中的ssDNA是用于基因编辑或DNA修复应用的有效模板。

图4描绘了几种细小病毒载体，包括常规细小病毒载体和不同的cce细小病毒载体实施方式。分图(A)描绘了具有单链(ss)DNA基因组的传统细小病毒。分图(B)描绘了具有互补双链(ds)基因组的cce细小病毒。分图(C)描绘了在ds模板的一条链上具有ss环区域的cce细小病毒。分图(D)描绘了具有感兴趣基因(GOI)3’的扩展的ss环区域的cce细小病毒，所述环区域限定了CCE结构域以及包括非互补区域。非互补ss序列可以包括任何DNA序列，例如编码适体/脱氧核酶的序列、编码多肽的序列、编码miRNA的序列、编码shRNA的序列、聚腺苷酸化信号、绝缘子序列等。适体可以通过其与邻近的侧接互补DNA序列的连接/附着来稳定。ccePV-LS中的单链DNA是用于基因编辑或DNA修复应用的有效模板。