[发明专利]重组细小病毒载体及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种双重细小病毒颗粒，其包含：

细小病毒衣壳；和

载体基因组，所述载体基因组在5’至3’方向包含：

(a)在5’端的细小病毒末端重复；

(b)在3’端的细小病毒末端重复；

(c)在(a)和(b)中的末端重复之间的双链(DS)DNA结构域，所述DS-DNA结构域包含与第二异源核苷酸序列退火的自互补的第一异源核苷酸序列；和

(d)在所述第一异源核苷酸序列和所述第二异源核苷酸序列之间的单链共价封闭端(SS-CCE)结构域，所述SS-CCE结构域包含环状结构；

其中所述DS结构域与自退火茎部分不连续，所述自退火茎部分包含来自突变反向末端重复(mTR)序列或短发夹DNA(shDNA)序列的超过20个连续核苷酸碱基对，并且

其中所述载体基因组被引入宿主细胞中时能够复制以形成所述双重细小病毒颗粒，所述宿主细胞表达足以产生所述双重细小病毒颗粒的辅助功能。

2.根据权利要求1所述的细小病毒颗粒，其中所述SS-CCE结构域不包含来自突变反向末端重复(mTR)或短发夹DNA(shDNA)序列的超过20个连续核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的细小病毒颗粒，其中所述SS-CCE结构域包含3至4,000个核苷酸，50至4,000个核苷酸，1,000至4,000个核苷酸，3至2,000个核苷酸，50至2,000个核苷酸，250至2,000个核苷酸，或500至2,000个核苷酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述SS-CCE结构域包含编码蛋白质或RNA的序列。

5.根据权利要求4所述的细小病毒颗粒，其中编码所述蛋白质或RNA的所述序列还包含与其可操作连接的下游聚腺苷酸化信号。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的细小病毒颗粒，所述第一异源核苷酸序列与所述第二异源核苷酸序列具有大于95％、大于99％或100％的反向互补性。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述DS结构域包含与编码蛋白质或RNA的核酸可操作连接的启动子。

8.根据权利要求7所述的细小病毒颗粒，其中所述DS结构域还包含与编码所述蛋白质或RNA的所述核酸可操作连接的聚腺苷酸化信号。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述DS结构域被环状或分支的单链DNA中断。

10.根据权利要求9所述的细小病毒颗粒，其中所述环状或分支的单链DNA包含编码蛋白质或RNA的核苷酸。

11.根据权利要求10所述的细小病毒颗粒，其中编码所述蛋白质或RNA的所述序列还包含与其可操作连接的下游聚腺苷酸化信号。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的细小病毒颗粒，其中(a)中的所述细小病毒末端重复包含左端发夹(LEH)，并且(b)中的所述末端重复包含右端发夹(REH)。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述细小病毒末端重复包含腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。