[发明专利]提高氨基酸球菌属CPF1的DNA切割活性的新型突变

说明书

本公开涉及氨基酸球菌属Cas12a(Cpf1)的多核苷酸和氨基酸及它们在真核细胞中用于基因组编辑的方法。

相关申请的交叉引用

本申请依据35 U.S.C.119要求于2019年7月3日提交的名称为“OPTIMIZED CAS12A(CPF1)PROTEINS FOR EFFICIENT GENOME EDITING IN EUKARYOTIC CELLS”的美国临时专利申请序列号62/870,268、于2018年10月23日提交的名称为“DEEP-SCANNING MUTAGENESISUNCOVERS NOVEL MUTATIONS THAT ENHANCE THE DNA CLEAVAGE ACTIVITY OFACIDAMINOCOCCUS SP.CAS12A/CAS12A AT NON-CANONICAL TTTT PAM SITES”的美国临时专利申请序列号62/749,607以及于2018年8月8日提交的名称为“NOVEL MUTATIONS THATENHANCE THE DNA CLEAVAGE ACTIVITY OF ACIDAMINOCOCCUS SP.CPF1”的美国临时专利申请序列号62/716,138的优先权，每个申请的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及利用CRISPR/Cas12a(Cpf1)核酸酶系统在精确位置处切割(cleave)活生物体的双链DNA的能力。具体地，描述了在真核细胞环境中有用的一系列重组Cas12a蛋白。

序列表

本申请含有经由EFS-网以ASCII格式提交的序列表并且在此以引用的方式整体并入。创建于______的ASCII副本的名称是_________并且大小是________个字节。

背景技术

Cas12a是发现于包括氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)的细菌物种中的RNA导向的核酸内切酶并且是成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)适应性免疫系统的一部分。通过靶位点特异性21～24-nt互补RNA，Cas12a导向至21～24-nt DNA靶序列，或通常称为前间隔序列。Cas12a-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体介导双链DNA断裂(DSB)，然后通过非同源末端连接(NHEJ，通常在剪切位点引入突变或插入缺失突变(indels))或者通过同源定向修复(HDR)系统(用于精确编辑，若存在合适的模板核酸的话)进行修复。

识别Cas12a的正确DNA靶标的关键包括crRNA和规范的“TTTV”前间隔序列邻近基序(PAM)两者，其是紧邻前间隔序列上游的4-bp序列。与来自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9的2-bp NGG PAM相比，Cas12a扩展了基因组编辑中的可靶向基因座，特别是在Cas9系统难以接触的富AT位点上。但是，由于其酶活性相对较低，对于给定位点可以实现有效的基因组编辑的可能性远低于Cas9系统，这限制了其更广泛的应用。因此，仅当Cas9无法靶向基因组位点时，才经常将Cas12a系统视为替代方法。

通过诱变进行的蛋白质工程改造可以改变CRISPR系统PAM序列的偏好。通过结构导向的PAM序列附近残基的诱变筛选，先前的研究已经鉴定出两个分别与TYCV和TATV PAM相容的AsCpf1变体。尽管这些变体共同将Cpf1系统的可靶向位点在人类基因组编码区扩增了3倍，但由于其对PAM序列的互斥要求(TYCV对(vs)TATV对TTTV)，每个变体的效用仍然有限。在不牺牲规范PAM位点处的活性的情况下，鉴定具有较短PAM和较大序列柔性的Cpf1变体是非常可取的。

因此，需要增强Cas12a的效用。本申请的一个方面是通过拓宽其PAM相容性来提高Cpf1的效用。就此而言，已经发现了某些具有提高活性的新型AsCas12a变体。另一个期望的目标是使细菌蛋白最大程度地传递至真核细胞的核，同时避免破坏基础Cas12a功能。由于Cas12a是细菌蛋白，因此必须首先克服某些分子遗传障碍，然后才能将蛋白质成功传递到真核细胞。本发明提供了实现这些目标的独特解决方案。