[发明专利]碱性磷酸酶组合物以及去磷酸化核酸和标记化核酸的制造方法

说明书

本发明的目的在于提供含有碱性磷酸酶的高品质的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法，为了实现该目的，本发明提供含有碱性磷酸酶、和第1～第6肽片段的组合物，所述第1～第6肽片段的含量相对于所述碱性磷酸酶的含量的比率分别满足下述式(1)～(6)：(X₁/Y)×100≤0.6000···(1)；(X₂/Y)×100≤0.1800···(2)；(X₃/Y)×100≤0.2000···(3)；(X₄/Y)×100≤0.8000···(4)；(X₅/Y)×100≤1.6000···(5)；(X₆/Y)×100≤0.3500···(6)。[式中，X₁～X₆分别表示由通过所述组合物的LC‑MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第1～第6肽片段的峰面积值，Y表示由通过所述组合物的LC‑UV分析而得的色谱利用自动积分法计算出的、所述碱性磷酸酶的峰面积值]。

技术领域

本发明涉及含有碱性磷酸酶的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法。

背景技术

碱性磷酸酶具有水解磷酸单酯的催化功能，在测定蛋白质、核酸等生物体物质的量的方法(例如，免疫染色法、ELISA、核酸微阵列法等)中被广泛使用。例如，在基因工程学的研究领域，为了DNA、RNA等核酸的标记化的前处理、防止载体的自身连接等，而使用碱性磷酸酶进行核酸的5’末端和/或3’末端的去磷酸化。

作为碱性磷酸酶的工业制法，由于其比活性高，因而主要以牛的小肠或大肠作为原料的制造方法被广泛采用。碱性磷酸酶的比活性的评价一般通过测定在对硝基苯基磷酸酯分解时产生的对硝基苯酚来源的405nm的吸光度来进行。

碱性磷酸酶的品质基于碱性磷酸酶比活性来评价。并且，为了获得比牛肠来源的碱性磷酸酶比活性高的碱性磷酸酶，一直以来通过纯化过程来分离高比活性的碱性磷酸酶，或者使用基因工程学的手法通过重组大肠菌来生产高比活性的碱性磷酸酶。

专利文献1中公开了使用导入了栗褐芽胞杆菌属来源的基因的重组大肠菌来制造具有高比活性的碱性磷酸酶的方法。另外，专利文献2中公开了使用导入了希瓦氏菌属来源的基因的重组大肠菌制造具有高比活性和耐热性的碱性磷酸酶的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-262674号

专利文献2：国际公开第2012/115023号

发明内容

发明所要解决的课题

含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂(例如，市售的碱性磷酸酶制品)是在含有碱性磷酸酶的同时，含有其他成分的组合物。含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂的品质基于碱性磷酸酶比活性进行评价。

然而，判明了即使是具有几乎相同的碱性磷酸酶比活性的去磷酸化试剂，使用该去磷酸化试剂制备的标记化核酸(通过该去磷酸化试剂将核酸的5’末端和/或3’末端去磷酸化，使去磷酸化后的核酸的5’末端和/或3’末端结合标记物质而得的标记化核酸)在核酸检测法中的检测灵敏度也产生较大的差异。即，判明了含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂的品质不能够以碱性磷酸酶比活性作为指标正确地评价。

于是，本发明的目的在于提供含有碱性磷酸酶的高品质的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法。

用于解决课题的手段

本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂(例如，市售的碱性磷酸酶制品)中能够混合存在以下的杂质。

·由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段