[发明专利]通过利用混合原料的全发酵进行的寡糖的发酵生产

说明书

本发明公开了用于生产在其还原端包含半乳糖‑β1,4‑葡萄糖部分的寡糖的遗传工程化的微生物细胞，其中所述微生物细胞能够在没有外源添加的乳糖的情况下生产所述寡糖，以及使用所述微生物细胞生产所述寡糖的方法。

本发明涉及能够产生乳糖或在其还原端包含半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的细菌宿主细胞，以及涉及产生乳糖或包含末端半乳糖-β1,4-葡萄糖部分的目的寡糖的方法。

背景技术

人乳包含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和微量元素的复杂混合物。人乳的最多的级分由碳水化合物组成。人乳中碳水化合物的级分可进一步分成(i)乳糖和(ii)寡糖(人乳寡糖，HMO)。鉴于乳糖(半乳糖-β1,4-葡萄糖)被用作能源，寡糖却不被婴儿代谢。寡糖的级分占总碳水化合物级分的最高达1/10，并且可能由150多种不同的寡糖组成。这些复杂寡糖的存在和浓度是人类所特有的，因此无法在其他哺乳动物(包括乳场动物)的乳中大量发现。

最重要的人乳寡糖为2’-岩藻糖基乳糖和3’-岩藻糖基乳糖，它们共同占总HMO级分的最高达1/3。人乳中存在的其他重要的HMO为乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖I。除这些中性寡糖以外，还可在人乳中发现酸性HMO，例如3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖以及3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、唾液酸-乳-N-四糖、二唾液酸-乳-N-四糖。值得注意的是，绝大多数HMO在它们的还原端包含半乳糖-β1,4--葡萄糖部分。HMO的结构与上皮细胞表面糖缀合物的表位(Lewis组织血型抗原，例如Lewis x(LeX))是近缘的。HMO与上皮表位的结构相似性说明了针对细菌病原体的HMO保护特性。

人乳中寡糖的存在早已为人所知，几十年来一直对这些寡糖的生理功能进行医学研究。对于一些更丰富的人乳寡糖，已经确定了特定的功能。

除了本文前面提到的肠道中的局部效应外，HMO还被证明通过进入婴儿的全身循环而引起全身效应。此外，HMO对蛋白质-碳水化合物相互作用(例如选择蛋白-白细胞结合)的影响可调节免疫应答和减少炎症应答。此外，越来越多的人认识到HMO是婴儿微生物群发育的关键底物。

由于益生元寡糖(特别是HMO)的有益特性得到充分研究，但其天然来源的可获得性受限，因此非常需要HMO的高效的商业(即大规模)生产。

为尝试大规模生产单个人乳寡糖，开发了这些寡糖中的一些的化学途径。然而，这些方法包括使用几种有毒化学品，这增加了污染最终产物的风险。迄今为止，还不能通过化学合成提供至少足以用于食品应用的大规模数量以及质量。

为了避免与人乳寡糖化学合成相关的缺点，开发了几种酶法和发酵法用于它们的生产。已开发了用于几种HMO的发酵生产方法，所述HMO为例如2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、3’-唾液酸乳糖和6’-唾液酸乳糖。这些生产方法通常使用遗传工程化的细菌菌株，如重组大肠杆菌(Escherichia coli)。

如今，生产HMO的所有发酵生产方法以及生物催化反应都完全基于外源添加的乳糖作为起始底物。在这些方法中向乳糖中添加一种或多种单糖(US 7,521,212 B1；Albermann et al.,(2001)Carbohydr.Res.334(2)第97-103页)。可以通过糖基转移酶或糖苷酶，使用合适的活化单糖底物催化单糖向乳糖中的添加。此外，可以通过转葡糖苷酶反应向乳糖中添加额外的单糖。

具体地，HMO的发酵生产被证明是有效的，因为由所使用的微生物细胞的代谢提供了必需但难以合成的核苷酸活化单糖。然而，与生物催化方法相比，利用全细胞合成HMO也有几个主要缺点，这些缺点涉及跨细胞膜的转运过程、代谢副反应以及由微生物细胞合成的寡糖必须被从尤其含有各种多元醇(例如碳水化合物)、核酸、多肽、无机材料等的复杂混合物中纯化的必要性。