[发明专利]检测串联重复的方法

说明书

本申请涉及使用引物在等温条件下检测核酸序列中的串联重复的方法。

本申请涉及使用引物在等温条件下检测核酸序列中的串联重复的方法。

可以针对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)真菌举例说明本发明的有效性，烟曲霉是全球范围存在的腐生物，由于其产生大量的风媒分生孢子而非常普遍存在于空气中。在临床上，烟曲霉引起一系列呼吸道感染和侵袭性感染，范围从哮喘样症状到免疫受损宿主中的侵袭性曲霉病。在临床上，三唑类抗真菌药因其在破坏膜结构和真菌细胞运输中的高效作用而被广泛用于控制这种真菌感染。但是，杀真菌剂也是利用固醇脱甲基化抑制剂(DMI)化合物控制农业真菌病害的重要手段，该固醇脱甲基化抑制剂(DMI)化合物是一类包括三唑类和咪唑类的化学物质，代表了全世界使用的最大的杀真菌剂种类。在环境方面，不仅在感染植物的真菌病原体中，而且栖于腐生土壤的烟曲霉中都观察到了对DMI的广泛耐药性的演变。该观察结果提示，三唑类在农业中的应用不仅在靶标作物病原体中而且在环境中共同存在并包括那些可能有机会感染人类的那些真菌物种中导致了选择出抗真菌性。

已知长期使用唑类疗法来治疗临床烟曲霉感染患者导致耐药性的从头演变(denovo evolution)(Snelders等人,Future Microbiology,6(3),335–347,2011)。但是，先前未用医用唑类药物治疗的未用药患者(patient)越来越多地被诊断为耐多唑性感染，导致以下假设：这些患者可能因其暴露于环境中的农业DMI而染上了对唑类演变出耐药性的感染因子(infectious agent)(Snelders等人,Applied and EnvironmentalMicrobiology,75(12),4053–4057,2009)。烟曲霉的耐唑性(azole resistance)与编码药物靶标羊毛甾醇14-α-脱甲基酶的cyp51A基因的启动子内的串联重复和突变有关。具体而言，在表现为感染耐唑性烟曲霉的患者中，越来越多地发现以cyp51A中的34bp串联重复(TR34)和亮氨酸-组氨酸取代(L98H)为特征的唑类耐药机制，而在最近的一些研究中，超过90％的耐三唑性烟曲霉感染患者携带TR34/L98H等位基因(Rivero-Menedez等人,Journalof Fungi,2(3),21,2016；Verweij等人,Clinical Infectious Diseases,62(3),362–368,2016)。重要的是，具有TR34/L98H组合的烟曲霉还广泛存在于环境样本中，包括土壤、堆肥、植物球茎和空气中(Rivero-Menedez等人,2016；Verweij等人,2016；Chowdhary等人,Journal of Antimicrobial Chemotherapy,67(2),362–366,2013)。使用高辨识度的遗传学和基因组学方法进行的流行病学研究显示，在自然界和临床感染中均存在含有TR34/L98H等位基因的密切相关的烟曲霉基因型，这使人们更加怀疑由于DMI抗真菌剂的双重使用，自然界中这种真菌的耐唑性分离株在临床上引起耐药性感染(Snelders等人,2009)。因此，迫切需要在临床和现场情况下检测和管理耐多唑性烟曲霉的快速诊断方法。通常使用常规的诊断方法(例如培养、显微镜检查和放射学)来检测由烟曲霉引起的感染(De Pauw等人,C.Clinical Infectious Diseases,46(12),1813–1821,2008)。但是，这些方法需要几天才能观察到真菌，仅具有中等特异性，并且需要进一步测试才能检测出耐唑性等位基因(Cuenca-Estrella等人,Journal of Antimicrobial Chemotherapy,66(SUPPL.1).2011)。已经开发了基于抗体的测试来快速检测感染，但是尚不能确定耐唑性的发生(MiceliMaertens,Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine,36(5),650–661,2015；White等人,Journal of Clinical Microbiology,51(5),1510–1516,2013)。基于PCR的分子方法由于其与传统方法相比灵敏度和特异性更高并且还能够检测耐唑性等位基因的存在而得到开发(Costa等人,Journal of Clinical Microbiology,40(6),2224–2227,2002；Donnelly,Clinical Infectious Diseases,42(4),487–489,2006；Kawazu等人,Journal of Clinical Microbiology,42(6),2733–2741,2004；Loeffler等人,TheJournal of Infectious Diseases,185(8),1203–1206,2002；MarrLeisenring,ClinicalInfectious Diseases,41(S6),S381–S386,2005；Pickering等人,Journal of ClinicalMicrobiology,43(12),5957–5962,2005；Raad等人,Cancer,94(4),1032–1036,2002；White等人,Clinical Infectious Diseases,61(8),1293–1303,2015)。但是，基于PCR的检测需要实验室设备和经验丰富的人员。耐唑性的持续增加，加上缺乏快速诊断方法，引起了对适用于现场和临床背景下简单、快速、准确诊断抗真菌突变的需求。