[发明专利]用于指导RNA设计和使用的方法和系统

说明书

本公开内容提供了用于设计用于与目标基因组区域杂交的指导RNA集的方法。本公开内容还提供了用至少一个指导RNA集编辑至少一个目标基因组区域的方法。

交叉引用

本申请要求2018年5月16日提交的美国临时申请号62/672,437的权益，该临时申请通过引用并入本文。

背景技术

设计用于靶向和操作特定DNA序列的工程化核酸酶技术正在迅速用作许多不同应用的有用技术，这些应用包括细胞和整个生物体的遗传操作、靶向的基因删除、替换和修复，以及外源序列(转基因)向基因组中的插入。基因组编辑技术的示例包括锌指、转录激活因子样效应物(TALE)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)(“CRISPR/Cas”)系统。

CRISPR/Cas系统可以用作多种不同生物体中的基因编辑工具，用于在靶位点产生断裂，随后在基因座引入突变。基因编辑过程可能需要两个主要组分：核酸内切酶(例如Cas酶)和识别特定DNA靶序列的短RNA分子。CRISPR/Cas系统可以依靠定制的短RNA分子将Cas酶募集到新的DNA靶位点上，而不是为每个DNA靶标设计核酸酶。Cas酶的实例包括Cas9和Cpf1。

CRISPR/Cas系统可以在原核和真核系统中用于基因组编辑和转录调控。在一些情况下，CRISPR/Cas系统会产生不必要的脱靶基因组编辑，并在不同基因靶标之间产生不同的编辑效率。

发明内容

本公开内容描述了与设计识别用于CRISPR/Cas介导的基因操作的相应靶寡核苷酸序列的一种或多种寡核苷酸(例如RNA分子)有关的技术，并且更具体地，本公开内容描述了在目标物种的整个基因组中确定脱靶值的方法，用于最小化脱靶基因组编辑并提高编辑效率。本公开内容描述了用于执行此类寡核苷酸的设计和验证的软件和硬件配置。

在某些实施方案中，本文描述了用于鉴定可与基因组中的目标基因组区域杂交的指导RNA(gRNA)集的方法，该方法包括：设计gRNA集，该gRNA集中的每个gRNA：可与来自目标基因组区域内的多个靶位点中的靶位点杂交，该靶位点与来自该指导RNA集的至少一个其他指导RNA的多个靶位点中的不同靶位点相距至少30个碱基。在一些实施方案中，靶位点与不同靶位点相距最多170个碱基。

在一些实施方案中，gRNA集中至少一个gRNA的序列与目标基因组区域互补。在一些实施方案中，gRNA集中至少一个gRNA的序列与目标基因组区域部分互补。在一些实施方案中，gRNA集中与目标基因组区域部分互补的至少一个gRNA的序列相对于目标基因组区域包含1个、2个、3个、4个、5个或大于5个错配。在一些实施方案中，gRNA集中的每个gRNA的长度为约17个至约42个碱基。在一些实施方案中，gRNA集中的每个gRNA的长度为约20个碱基。在一些实施方案中，gRNA集中的每个gRNA包含约20个碱基的指导序列，并且还包含长度为约22个至约80个碱基的恒定区。在一些实施方案中，gRNA集中的每个gRNA的指导序列选择性地与目标基因组区域杂交。在一些实施方案中，初始gRNA集中的每个gRNA的长度为约100个碱基。

在一些实施方案中，目标基因组区域包含基因的编码区域。在一些实施方案中，目标基因组区域包含基因的外显子。在一些实施方案中，目标基因组区域包含基因家族。在一些实施方案中，目标基因组区域包含来自基因家族的一个或多个编码区域。在一些实施方案中，目标基因组区域包含基因组的非编码区域。在一些实施方案中，非编码区域是调控元件。在一些实施方案中，调控元件是顺式调控元件或反式调控元件。在一些实施方案中，顺式调控元件选自：启动子、增强子和沉默子。