[发明专利]病毒载体产生

说明书

包膜病毒颗粒产生者或包装细胞，其中所述细胞经遗传工程化改造以减少细胞表面上CD47的表达。

发明领域

本发明涉及显示降低的表面暴露抗原水平的细胞。更具体地，本发明涉及细胞的遗传工程以减少细胞表面上CD47的表达。特别地，本发明涉及此类细胞在包膜病毒颗粒的产生中的用途。

发明背景

基因疗法涉及将遗传物质掺入细胞中以治疗或预防疾病。遗传物质可以给缺陷基因补充那些基因的功能拷贝，使不能正常发挥功能的基因失活或将指导新功能的基因引入细胞。

遗传物质向细胞的递送可以通过使用促进核酸转移的载体来实现。可以对病毒进行工程化改造以将感兴趣的核苷酸(NOI)递送至靶细胞，并通常在基因疗法中用作载体。迄今为止，已用于基因疗法的病毒包括逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺伴随病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和痘苗病毒。

逆转录病毒，例如α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒、慢病毒和泡沫病毒对于基因疗法特别有用，因为它们允许将校正性遗传物质稳定整合到靶细胞中。在针对腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷(ADA-SCID；Aiuti,A.et al.(2009)N.Engl.J.Med.360:447-58)，X-连锁严重联合免疫缺陷(SCID-X1；Hacein-Bey-Abina,S.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:355-64)和Wiskott-Aldrich综合征(WAS；Boztug,K.et al.(2010)N.Engl.J.Med.363:1918-27)的基于γ-逆转录病毒衍生的载体的临床试验中已经实现了治疗益处。另外，慢病毒载体已被用作递送载体，用于治疗X连锁的肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy)(ALD；Cartier,N.et al.(2009)Science 326:818-23)，以及异染性脑白质营养不良(MLD；Biffi,A.et al.(2013)Science 341:1233158)和WAS(Aiuti,A.et al.(2013)Science 341:1233151)。在临床前研究中，慢病毒载体也已静脉内施用，用于在该疾病的小鼠和犬模型中进行血友病的肝定向基因疗法(Cantore,A.et al.(2012)Blood；Matsui,H.et al.(2011)Mol Ther；Cantore,A.et al.(2015)Science Translational Medicine 7:277ra28)。

已经进行了努力以获得能够逃脱免疫细胞感应的基因疗法载体，以将其用于遗传疾病的稳定的基因替代治疗策略中。然而，基因转移载体的许多应用需要将基因有效传递给先天免疫细胞，例如，将载体用作溶瘤病毒(Lichty,B.D.et al.(2014)Nature RevCancer 14:559-567)以及用于疫苗接种的目的(Rampling et al.(2015)NEJM)。

病毒颗粒包膜通常起源于产生者细胞的膜。因此，在病毒颗粒出芽的细胞膜上表达的膜蛋白可以掺入病毒包膜中。此类表面暴露的蛋白质可能影响病毒颗粒作为基因疗法载体的效用，例如通过改善或防止某些类型的细胞转导，或引起针对病毒颗粒或它们转导的细胞的有害免疫应答。相反，对于某些效用，例如疫苗接种目的，可能希望刺激免疫系统。

因此，在本领域中，对具有改善的细胞转导特性以及刺激或逃避免疫应答的病毒载体颗粒的需求相当大。

发明概述

令人惊讶地，发明人发现，基因对专职的吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)的转移受到LV颗粒上CD47分子的存在的限制。

通过遗传破坏用于产生LV颗粒的细胞中的CD47基因，发明人能够修饰LV包膜的蛋白质组成，并获得在其表面上缺乏人CD47的LV颗粒(无CD47的LV)。令人惊讶地，发明人已经显示，表面暴露的CD47分子的缺乏对细胞无毒，并且不会显著影响这些细胞产生包膜病毒颗粒的能力。