[发明专利]用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚体治疗血管发生、纤维化和癌症相关疾病的手段和方法

说明书

本发明涉及生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N‑至C‑端包含融合至具有“杵”突变的人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC‑1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC‑1的具有“杵”突变的人IgG1 Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1 Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表达，以及b)获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体。

本发明涉及生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N-至C-端包含，融合至具有“杵”突变的人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1 Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表达，以及b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。本发明进一步涉及生产包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达融合蛋白的宿主细胞，所述融合蛋白从N-至C-端包含：融合至人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1 Fc，其中所述人IgG1 Fc包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E，以及b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。进一步地，本发明提供蛋白寡聚体，其包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白，所述蛋白寡聚体用于治疗、改善或预防与血管发生有关的疾病，其中所述异源二聚体人NC-1-Fc蛋白包含(i)融合蛋白，其从N-至C-端包含：融合至具有“杵”突变的人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1 Fc，和(ii)具有“臼”突变的人IgG1 Fc，其中人IgG1 Fc中的所述“杵”突变和“臼”突变是如本申请所限定的。本发明还涉及单体NC-1-Fc蛋白，其包含来自胶原蛋白18的人NC-1和来自人IgG1的Fc结构域，其中来自人IgG1的Fc结构域包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E。本发明还涉及包含至少两个所述单体人NC-1-Fc融合蛋白的蛋白寡聚体，其用作药物，优选地用于治疗与血管发生有关的疾病、纤维化或与纤维化相关的疾病、血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。

由Folkman实验室(OReilly等，Cell 88(2)：277-85，1997)1997年生产的原始重组内皮抑制素是在大肠杆菌中生成的不溶性聚集体，其被皮下注射至小鼠。随后，可溶性内皮抑制素在酵母中产生。Entremed单体内皮抑制素在关键的N-端Zn2+结合结构域中缺乏很大一部分。此种单体内皮抑制素在一期试验中显示出中等程度的反应，且生产成本很高，以至于仅进行了少量试验(有关综述，请参见Abdollahi DRU 2015PMID:15939343)。

中国科学家通过向N-端添加His标签来开发恩度(Endostar)，导致更好的增溶作用，并发现了一种重折叠程序以在细菌培养物中产生内皮抑制素单体，该内皮抑制素单体在非小细胞肺癌中有效(US7078485B2)并获得了中国FDA的批准。