[发明专利]用于基于呈球状形式的大小来选择多核苷酸的方法

说明书

本发明提供了基于呈球状形式的多核苷酸大小来选择多核苷酸的方法。所述多核苷酸可以用凝聚介质，例如包括聚乙二醇，例如PEG8000和盐来处理以采用球状形式。所述方法可以采用过滤以保留较大的核酸以及使较大的核酸可用于测序应用，诸如纳米孔测序。本发明还涉及用于选择多核苷酸的试剂盒。

技术领域

本发明总体上涉及选择多核苷酸的方法。本发明总体上还涉及表征多核苷酸的方法，以及涉及用于选择多核苷酸的试剂盒。该方法特别适合于选择用于测序应用，诸如纳米孔测序的多核苷酸。

背景技术

基于大小的多核苷酸的选择对于许多应用，诸如对DNA和RNA进行测序是重要的。存在广泛应用中的快速且廉价的多核苷酸表征、鉴定、扩增和测序技术的需要。多核苷酸的长度可以有助于多核苷酸的鉴定。多核苷酸的长度和完整性也可以影响下游鉴定、扩增或测序应用的成功和迅速性。许多高通量DNA测序仪需要一定大小的插入文库以获得最佳性能。对于多核苷酸大小选择非常重要的应用的其他实例包括确保正确的PCR产物形成、基因分型、DNA指纹分析、基因谱分析、以及例如在多核苷酸的酶消化之后提取限定大小的片段。

常规上通过凝胶电泳检测不同大小的DNA。手动凝胶电泳方法具有许多缺点。例如，在商业上有用的规模上实现高通量分离所需的设备可能是昂贵的和/或复杂的；允许使用凝胶电泳对DNA进行处理所需的处理步骤可能会有污染或降解DNA样品的风险；和/或过程可能涉及使用有害化学物质，诸如常规用于对DNA进行染色的溴化乙锭。已经开发了可以分离和选择在100bp与50kb之间的期望大小范围的DNA的自动电泳仪器，但是它们是复杂且昂贵的。

在不同反应条件下的功能化顺磁性二氧化硅颗粒可以用于DNA大小选择。通常，这些方法仅允许长度1kb的DNA的分离。使用固体基质的尺寸排阻方法也可以使用，但同样，这些方法通常用于从1000kb+片段中去除短1kb的DNA片段。因此，这些方法通常不适合处理更长的DNA样品。

用于基于大的DNA分子的大小选择的常规技术的常见的关键问题是大的DNA分子在操作期间易于剪切。剪切是由于溶液流动期间的应力而产生的，并且在小型化系统中会增加。当操作大的DNA分子时，DNA的剪切代表一个严重的问题。

因此，需要一种简单有效的方法来分离不同大小的DNA分子。特别需要分离DNA分子同时避免或减轻剪切作用的方法。本文提供的方法解决了这一需要，以及旨在解决与常规分离技术相关的上述问题的一些或全部。

发明内容

发明人设计了从包括多核苷酸的混合物的样品中选择多核苷酸的简单且有效的方法。发明人发现呈球状形式的多核苷酸可以容易地以稳健且可再现的方式进行大小选择。因此，发明人开发了基于呈球状形式的多核苷酸的大小选择多核苷酸的方法。本文提供的方法可以用于选择期望长度的多核苷酸。发明人开发的方法与常规的大小选择技术(例如，上文列出的那些)有很大不同，常规的大小选择技术通常依赖于呈非球状形式的多核苷酸。令人惊讶地，发明人进一步发现，相对于在未进行大小选择的样品上获得的数据，通过选择呈球状形式的多核苷酸，可以从所述进行大小选择的样品获得的表征数据(例如测序数据)的质量得到改善。不受理论的束缚，发明人相信，这样的益处可以至少部分地通过避免剪切并因此获得高质量的同源多核苷酸样品而产生。

因此，本文提供了用于选择多核苷酸的方法，所述方法包括：

i)提供包括多核苷酸的混合物的样品；以及

ii)基于呈球状形式的多核苷酸的大小来选择多核苷酸。

优选地，所述方法包括包括最初处理所述样品，使得所述样品中的多核苷酸采用球状形式和/或在选择步骤(ii)之后，优选地处理所述选择的多核苷酸，使得所述选择的多核苷酸采用非球状形式。优选地，选择所述多核苷酸包括通过滤器过滤所述样品。所述样品可以，例如：

a)包括PCR反应的产物；和/或

b)包括DNA文库；和/或