[发明专利]用于稳定核酸-核苷酸-聚合酶复合物的方法和组合物

说明书

包括流体的方法、组合物、试剂盒和装置，所述流体包含三元复合物和Li⁺，其中所述三元复合物包括引发的模板核酸、聚合酶和引发的模板核酸分子的下一个正确碱基的核苷酸同源物。作为Li⁺的替代品或补充品，所述流体可以包含甜菜碱或抑制聚合酶催化的金属离子，诸如Ca²⁺。除了Li⁺以外，所述流体还可包含聚乙烯亚胺(PEI)并含有或不含甜菜碱。

相关申请的交叉引用

本申请基于2018年4月26日提交的美国临时申请第62/662,888号，并要求保护其权益，所述申请通过引用整体并入本文。

发明背景

本公开总体上涉及核酸的捕获、检测和测序。更具体地，本公开涉及例如Sequencing By Binding^TM(SBB^TM)法中三元复合物的形成和检测，每个三元复合物包括引发的模板核酸、聚合酶和同源核苷酸。

SBB^TM技术利用聚合酶和同源核苷酸与引发的模板核酸的瞬时结合作为鉴定处于引物末端的模板碱基的手段。延伸引物和检测下一个模板碱基的一系列步骤允许确定模板的序列。例如，在共同拥有的美国专利申请公布2017/0022553 A1和2018/0044727 A1以及美国专利申请序列第15/873,343号(公布为US 2018/0208983 A1)和第15/851,383号(公布为US 2018/0187245 A1)中公开了示例性SBB^TM技术，所述美国专利申请每一篇均通过引用并入本文。

SBB^TM技术的难点在于三元复合物是平衡结合产物。平衡结合产物在溶液中与未结合的结合配偶体共存。从平衡反应中除去未结合的结合配偶体会导致结合产物解离。当在SBB^TM方法中使用标记的核苷酸时，未结合的标记的核苷酸提供了维持平衡的期望功能，这反过来维持三元复合物。然而，未结合的标记的核苷酸不期望地产生背景信号，该背景信号会使三元复合物的检测模糊不清。当用标记的聚合酶代替标记的核苷酸时，也会出现类似的困难。

需要保持三元复合物的可检测水平，同时降低标记的背景组分的浓度的方法。本发明满足了这一需求，并且还提供了相关的有利方面。

发明内容

本公开提供了包括流体的方法、组合物、试剂盒和装置，所述流体包含三元复合物和Li⁺，其中三元复合物包括引发的模板核酸、聚合酶和引发的模板核酸分子的下一个正确碱基的核苷酸同源物。作为Li⁺的替代或补充，所述流体可含有甜菜碱和/或抑制聚合酶催化的金属离子诸如Ca²⁺。除了Li⁺以外，流体还可包含聚乙烯亚胺(PEI)并含有或不含甜菜碱。

还提供了检测引发的模板核酸的方法，其包括以下步骤:(a)提供含有三元复合物和Li⁺的流体，其中三元复合物包括引发的模板核酸、聚合酶和引发的模板核酸分子的下一个正确碱基的核苷酸同源物；以及(b)当三元复合物在含有Li⁺的流体中时，检测所述三元复合物。任选地，所述方法还包括步骤(c)：根据步骤(d)的结果鉴定引发的模板核酸分子的下一个正确碱基。作为Li⁺的替代品或补充品，所述流体可含有甜菜碱和/或抑制性金属离子诸如Ca²⁺。除了Li⁺以外，所述流体还可含有PEI并含有或不含甜菜碱。