[发明专利]用于验证核酸扩增测定的方法和系统

说明书

提供了用于测定系统的外部对照测试的系统、方法和仪器。

政府利益

本发明在由美国国立卫生研究院（U.S. National Institutes of Health）授予的HHSN272201600002C以及由美国国防部（U.S. Department of Defense）授予的W911QY-13-D-0080的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。

相关申请

本申请要求于2018年1月30日提交的美国临时申请序列号U.S. 62/623,802的利益和优先权，所述美国临时申请整体引入本文作为参考。

背景

在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的大约7%，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40%。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现中有发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和腹泻带血。虽然身体表现提示由一些病原体引起的疾病并且消除作为病因因子的其它病原体，但仍然存在各种潜在的致病因子，并且明确的诊断经常需要执行各种测定。用于鉴定临床标本中的病原体的传统微生物学技术可能花费几天或几周，经常延迟正确的治疗过程。

近年来，聚合酶链反应（PCR）已成为用于快速鉴定传染原的选择方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏且特定性的工具。然而，使用PCR作为主要诊断手段的挑战在于一些病理标本中存在的可能的致病性生物或病毒的多样化以及生物或病毒的低水平。运行PCR测定（对于每种可能的致病性生物或病毒一个PCR测定）的大型实验对象组经常是不切实际的，大多数所述PCR测定预计为阴性的。当病原体核酸为低浓度且需要大体积的样品以收集足够的反应模板时，该问题恶化。在一些情况下，没有足够的样品来测定所有可能的病因因子。一种解决方案是运行“多重PCR”，其中样品在单一反应中就多个靶同时进行测定。尽管多重PCR已在一些系统中证明为有价值的，但存在关于高水平多重反应的稳固性和难以明确分析多重产物的缺点。为了解决这些问题，随后可以将测定分成多重次级PCR。在初级产物内嵌套次级反应增加稳固性。封闭系统如FilmArray®（BioFire Diagnostics，LLC，Salt Lake City，UT）减少了处理，从而降低了污染风险。

质量控制（‘QC’）材料是必要的，以确保体外诊断（‘IVD’）系统正确运行。例如，QC材料在制造时在FilmArray测定袋上运行，以确认该袋根据规格制造，并且确认测定和器械正确地操作。根据1988年临床实验室改进修正案（Clinical Laboratory ImprovementAmendments of 1988）（CLIA），要求美国的临床实验室对收到的每个批次的测定运行所谓的外部对照材料（‘ECM’），其为测定阳性和阴性的，以确保每个批次中的IVD测定根据规范执行，并且确保实验室的程序对于检测预期通过IVD测定检测的生物是正确的。ECM还用于验证对新器械或维修器械以及新用户的测定性能。在大多数情况下，临床实验室已使用充分表征的阳性临床标本或掺料到已知阴性标本内的活病原体。尤其对于病原性生物，可以使用灭活的生物来配制ECM。在复杂性较低的实验室（例如医师办公室实验室）或者用于罕见或高病原性生物的测定中，合成核酸模板也可以用作ECM。许多其它行业的非临床实验室也运行对照材料，例如ECM。

技术问题

然而，这种方法的问题之一是生物和核酸阳性对照具有污染未来测定并产生假阳性的潜力。在扩增后，PCR反应混合物可以含有多达10¹¹至10¹²个原始靶的拷贝。鉴于对于传染性病原体的基于PCR的测定对靶序列的50个拷贝敏感的需要，这意味着~10^-8 μL（大致上一滴的十亿分之一）的扩增后混合物含有足够的靶来污染后续扩增过程，并导致假阳性结果。避免此类携带污染或致使其无害是艰巨挑战。