[发明专利]制备免疫原性组合物的方法

说明书

本发明特别涉及制备展现降低的杀病毒活性的免疫原性组合物的方法，以及所述免疫原性组合物，及其用途，其中所述方法特别包含以下步骤：(a)提供具有第一液体及重组蛋白的混合物，(b)通过从所述混合物去除所述第一液体的一部分而浓缩所述混合物中的重组蛋白，及(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液。

技术领域

本发明涉及制备免疫原性组合物的方法以及展现降低的杀病毒活性的这些免疫原性组合物。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)是小的(直径17-22nm)、二十面体、无包膜DNA病毒，其含有单链环状基因组。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV1)共享约80％序列相同性。然而，与通常无毒力的PCV1相反，经PCV2感染的猪展现一种通常称为断奶后多系统消耗综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长迟滞(unthriftiness)、呼吸窘迫、腹泻、黄疸病(icterus)和黄疸(jaundice)。在一些受影响的猪中，所有症状的组合将是明显的，而其他猪仅会具有一个或两个这些症状。在尸检期间，微观及宏观的病灶也出现在多个组织及器官上，其中淋巴器官是病灶的最常见位点。已观察到PCV2核酸或抗原的量与微观淋巴病灶的严重性之间存在强烈的相关性。经PCV2感染的猪的死亡率可接近80％。除了PMWS外，PCV2也与其他若干感染相关，包括伪狂犬病、猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)、格拉氏病(Glasser’s disease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝功能病及化脓性支气管肺炎。

有若干疫苗可用于降低猪中PCV2感染的影响。美国专利第6,703,023号提供用于猪预防PMWS的基于DNA的疫苗。在WO 03/049703中，描述活的嵌合疫苗的制备，该疫苗包含非病原体PCV1病毒，然而，其中ORF2蛋白被病原体PCV2的ORF2蛋白置换。WO 99/18214及WO99/29717已提供若干PCV2毒株及制备杀死的PVC2疫苗的方法。亚单位疫苗的制备也描述于WO 99/18214及WO 99/29717中。WO 06/072065中报道有效的基于ORF2的亚单位疫苗。另一基于ORF2的亚单位疫苗也描述于WO 07/28823中。

具有约30kDa的分子量的PCV2的开放阅读框2(ORF2)蛋白，当在SDS-PAGE凝胶上运行时，过去曾用作PCV2的疫苗及免疫原性组合物的抗原性组分。获得用于这些疫苗及组合物的ORF2的典型方法通常由以下组成：扩增编码ORF2的PCV2 DNA、在宿主细胞内表达ORF2蛋白及经由细胞裂解从宿主细胞提取ORF2蛋白。然后将回收的ORF2细胞裂解物用作免疫原性组合物或疫苗的抗原性部分。在一些情形下，含有ORF2的细胞裂解物与细胞碎片分离。

针对PCV2的免疫原性组合物及针对其他病原体的各种免疫原性组合物通常对其他抗原具有杀病毒效应。例如，美国目前的监管标准(9CFR 113.35)允许多价组合物中的一些杀病毒活性，但当与免疫原性组合物的其他组分组合时，此杀病毒活性不可导致超过0.7log/mL的活病毒或小于0.7log/mL CFU的活细菌的丧失。具有比允许的更大的杀病毒活性的组合物不能与其他抗原组合以产生多价疫苗。

为此，WO 11/28888提供降低包含PCV2抗原的组合物的杀病毒活性的方法以及包含PCV2抗原的抗原性制剂及免疫原性组合物，其中杀病毒活性已降低。更具体地，WO 11/28888教导大规模制备该PCV2抗原性组合物的方法，其中该方法包含以下步骤：

i)获得其中含有包含ORF2蛋白的病毒样颗粒的PCV2抗原的第一液体；及

ii)通过利用过滤器的过滤步骤从包含ORF2蛋白的病毒样颗粒的PCV2抗原去除第一液体的至少一部分，其中该过滤器包括平均孔径小于PCV-2抗原的半透膜，从而防止至少90％的PCV2抗原通过半透膜孔并将PCV2抗原保持在过滤器内，其中通过交换第一液体与第二液体的部分从PCV2抗原去除第一液体的部分，其中第二液体与第一液体不同，且其中第一液体与第二液体的部分的交换包含以下步骤：