[发明专利]使用芽孢杆菌系统产生肉毒神经毒素

说明书

本文中描述了包含编码肉毒神经毒素(BoNT)的核苷酸序列的芽孢杆菌(Bacillus)细胞和产生所述BoNT的方法。

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2018年1月30日提交且标题为“PRODUCTIONOF BOTULINUM NEUROTOXINS USING BACILLUS SYSTEMS”的美国临时申请No.62/623715的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

肉毒神经毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)产生的致死性毒素。这些毒素可特异性地靶向多种脊椎动物的神经元末端，阻断神经元递质释放，并引起通常称为“肉毒中毒(botulism)”的松弛性瘫痪。BoNT的神经元阻断活性可用于治疗性目的，尤其是用于神经元相关疾病，例如睑痉挛、斜视、上运动神经元综合征、发汗(sweating)、颈肌张力障碍和慢性偏头痛。BoNT还广泛用于化妆品工业。

发明内容

本公开内容的一些方面提供了在芽孢杆菌(Bacillus)中重组产生肉毒神经毒素(BoNT)的方法，该方法包括在适合于表达BoNT的条件下培养包含编码BoNT的核苷酸序列的芽孢杆菌细胞。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列与启动子可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列在表达载体中。在一些实施方案中，表达载体选自：pHT01、pHT08、pHT09、pHT10、pHT43、pHT253、pHT254、pHT 255、pNZ8901、pNZ8902、pNZ8910、pNZ8911、pWH1520、pMM1522、pMM1525、pHIS1522、pHIS1525、pSTREP1525、pSTREPHIS1525、pC-His1622、pC-Strep1622、pN-His-TEV1622、pN-Strep-TEV1622、pN-StrepXa1622、pSTOP1622、p3STOP1623hp、pC-HIS1623hp、pN-His-TEV1623hp、pSP-LipA-hp、pSP-YocH-hp、p3STOP1623-2RBShp、pC-STREP1623hp、pN-STREP-Xa1623hp、pN-STREP_TEV1623hp、pMGBm19、pPT7、pPT7-SPlipA、pPconst1326、pBP26、pBP27、pBQ200、pGP380、pGP382、pGP886、pGP888、pGP1459、pGP1460、pGP1389、pBE-S和pRB374。

在一些实施方案中，BoNT在N或C端与融合结构域融合。在一些实施方案中，融合结构域是亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签选自：His6、GST、Avi、Strep、S、MBP、Sumo、FLAG、HA、Myc、SBP、E、钙调蛋白、Softag 1、Softag 3、TC、V5、VSV、Xpress、Halo和Fc。

在一些实施方案中，编码BoNT的核苷酸序列被密码子优化以在芽孢杆菌中表达。

在一些实施方案中，BoNT选自：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/X、BoNT/En，及其变体。在一些实施方案中，BoNT是非催化活性BoNT。在一些实施方案中，BoNT是全长BoNT。在一些实施方案中，BoNT是嵌合BoNT。在一些实施方案中，BoNT包含与SEQ ID NO二1至139中任一个具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，BoNT包含SEQID NO：1至139中任一个的氨基酸序列。