[发明专利]库制备

说明书

本公开提供在衔接子接合与PCR扩增之间不需要纯化的DNA库制备方法。将衔接子添加到DNA片段以形成寡核苷酸延伸产物，并且在不停止或中断以进行净化步骤的情况下扩增所述寡核苷酸延伸产物。来自衔接子添加步骤的过量材料(如酶、衔接子或辅因子)不会干扰扩增步骤并且所述扩增步骤的进行不考虑来自接合步骤的试剂的存在。在优选实施例中，所述接合步骤和扩增步骤利用共同引发序列，例如呈衔接子寡核苷酸中的一个的形式。

技术领域

本发明涉及制备用于下一代测序的DNA库。

背景技术

DNA的下一代测序(NGS)可快速提供大量医学上重要的遗传信息。NGS测序仪器对由临床或生物样品制备的DNA库进行操作。DNA库制备通常使用商业试剂盒，所述商业试剂盒随附用于分离所关注的基因的试剂和说明书。一种常用库制备型试剂盒是由启迪公司(Illumina)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))以商标TRUSEQ出售的库制备型试剂盒。

典型库制备试剂盒和方案提供输入DNA的片段化，随后进行末端修复、珠粒净化、A加尾、衔接子接合、珠粒净化、PCR扩增和最终珠粒净化。净化步骤可通过其它已知方法进行，但使用磁珠的净化是流行的，因为使用来自如安津考特(Agencourt)等公司的商业上可获得的试剂盒和说明书相当简单。

虽然费时，但珠粒净化被认为是库制备中的必要步骤，因为来自一个步骤的过量试剂如果不被去除，将会干扰或妨碍后续步骤的成功完成。具体来说，应理解，在接合之后需要纯化以去除与后续PCR扩增不相容的衔接子和其它接合反应组分，例如高浓度的镁和PEG。此外，现有方案需要不同的PCR引物以便扩增功能性最终测序库。

发明内容

本公开提供不需要在衔接子接合与PCR扩增之间纯化并且其中衔接子寡核苷酸可在扩增期间充当引物的DNA库制备方法。在优选实施例中，将衔接子添加到DNA片段上，并且接着在无中间净化步骤的情况下扩增所述片段。实际上，在一些实施例中，起始衔接子的至少一个寡核苷酸链可以充当扩增引物。

在一些实施例中，部分双链衔接子在DNA片段的两端接合到游离5'端上，此后延伸3'端以复制完整衔接子序列。衔接子可为至少部分双链的以通过接合酶促进识别和酶催化。在片段跨越衔接子的主链延伸之后，使衔接子的次要链移位，所得的衔接子接合片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增。本公开包括展示在衔接子接合与扩增之间不需要纯化或净化步骤的结果。因此，在扩增期间可能仍存在为衔接子接合而存在的材料，包括如衔接子、酶、辅因子等的材料。衔接子和衔接子添加的其它实施例在本公开的范围内。

在某些实施例中，第一衔接子接合到DNA片段上并且第二衔接子与其杂交，之后第二衔接子延伸穿过第一衔接子以形成扩增的寡核苷酸延伸产物。扩增甚至可以使用第二衔接子作为引物。在不停止或中断以进行净化步骤的情况下扩增寡核苷酸延伸产物。来自衔接子接合步骤的过量材料(如酶、衔接子或辅因子)不会干扰扩增步骤并且扩增步骤的进行不考虑来自接合步骤的试剂的存在。实际上，在优选实施例中，接合和扩增步骤利用共同引物，第二衔接子寡核苷酸。

本公开的方法适用于单引物富集，其中靶标特异性引物和衔接子用于衔接子接合步骤并且接着还在扩增步骤中用作引物。在此类实施例中，将靶DNA片段化，并且接合索引的正向衔接子。将包含靶探针和反向衔接子的寡核苷酸退火到片段上并且延伸。使所得ds产物变性，并且使PCR引物退火以用于扩增和库富集。

所述方法的实施例在PCR步骤之后只需要单一纯化或珠粒净化。本公开的方法与DNA的机械和酶催化剪切两者相容。根据本公开使用的衔接子允许接合和PCR扩增两者，而无需添加不同PCR引物(其需要具有Illumina Y-衔接子)。因此，本公开提供其中消除接合后珠粒净化的库制备方法。根据本公开的方法的库制备可在不超过单一纯化或珠粒净化步骤的情况下进行，并且产生用于测序的高质量库。库制备方法使用也充当PCR引物的测序衔接子。另外，本公开的方法与酶催化和机械DNA片段化两者相容。