[发明专利]CAR-T细胞的封闭系统制造过程

说明书

本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中，以单个无血清体积培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，可用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞，并且可在比其他常规方法更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。

相关的申请

本申请要求2018年2月6日提交的名称为“CAR-T细胞的封闭系统制造过程”的美国临时申请No.62/627,129的优先权，以引用的方式将其整体明确地并入本文。

技术领域

本文提供的一些实施方式涉及用于制备基因修饰T细胞的方法和组合物。在一些此类实施方式中，以单个无血清体积(single serum-free volume)培养CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方式中，用慢病毒载体转导共培养的CD4+和CD8+T细胞，并且与常规方法相比，在更短的时间内收获经转导的T细胞的群体。

背景技术

细胞的基因修饰已用于许多领域，例如研究、医学、工业生物技术和农业。存在多种用于将基因插入宿主基因组中的可用技术。例如，可通过细胞的核被膜而将核酸直接注射到细胞核中，或使用病毒载体将核酸给予至细胞以产生基因修饰细胞。

用病毒载体进行的转染是在称为病毒转导的技术中产生基因修饰细胞(例如T细胞)的常用技术。使用诸如慢病毒或腺病毒的病毒作为载体将核酸引入细胞。

病毒转导可用于使用质粒在细胞(例如哺乳动物细胞)中插入或修饰基因。病毒转导中使用的质粒包含侧翼为病毒序列的待转移的基因，所述病毒序列被病毒蛋白质用来识别病毒基因组并将其包装成病毒颗粒。该质粒与可能携带形成感染性病毒粒子所需的病毒基因的其他DNA构建体一起插入细胞。由这些包装构建体表达的病毒蛋白可结合待转移并插入病毒颗粒中的DNA/RNA上的序列。通常，出于安全原因，所使用的质粒均不包含病毒形成所需的所有序列，因此需要同时转染多个质粒以获得感染性病毒粒子。而且，仅携带有待转移序列的质粒包含允许将遗传物质包装在病毒粒子中的信号，从而使得编码病毒蛋白的基因都不会被包装。然后将从这些细胞收集的病毒应用于待改变的细胞。这些感染的初始阶段模拟天然病毒的感染，并引起经转移的基因的表达以及(在慢病毒/逆转录病毒载体的情况中)待转移的DNA向细胞基因组中的插入。然而，由于经转移的遗传物质不编码任何病毒基因，因此这些感染不会产生新病毒。

发明内容

本文描述的一些实施方式涉及比起常规方式，以最少的物理操作并在更短的时间段内制备经慢病毒修饰的T细胞的方法。在一些实施方式中，将T细胞的CD4和CD8亚群置于由基础培养基、蛋白质补充剂和细胞因子混合物制成的独特(unique)培养基组合物中的共培养物中。也可在该体系中通过磁性地富集T细胞并将转导混合物在原位与细胞孵育确定或选定的时间进行慢病毒修饰。