[发明专利]用具有新颖引物组的LAMP测定检测草坪草中真菌的方法

说明书

本发明提供了一种用环介导等温扩增(LAMP)测定检测草坪草样品中真菌DNA的方法，该测定含有用于至少一种草坪病原性真菌的真菌DNA的引物，这些草坪病原性真菌选自：币斑病核盘菌、立枯丝核菌物种、瓜果腐霉菌、禾顶囊壳菌物种、雪霉叶枯菌物种、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和终极腐霉菌终极变种，该方法包括：使草坪样品经受LAMP反应，其中该LAMP反应使用四个或更多个核酸序列的引物组，该组中的每个引物具有15个到50个核酸。可用于本方法的引物选自靶标真菌的特异性选择的内部转录间隔区或基因，以提供改进的测定结果。

本发明涉及检测由真菌病原体引起的草坪草中病害的方法，该方法用环介导等温扩增(LAMP)测定这样的草坪草样品以检测来自一种或多种真菌的核酸。

如在例如US 6410278(Eiken公司)中所述，LAMP或环介导等温扩增是一种DNA扩增方法，其特征在于使用至少4个或更多个不同的引物(参见，例如，http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html)，这些引物被特异性设计以识别靶基因上的6个不同区域，并且反应过程在恒定的温度下通过链置换反应进行。通过将生物样品或其核酸提取物、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶、和底物的混合物在恒定的温度下(大约65℃)孵育，可在单个步骤中完成目的靶核酸的扩增和检测。它提供了高扩增效率，其中DNA在15-60分钟内被多次扩增。由于其高特异性，扩增产物的存在可以表明靶基因的存在(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html)。

草坪草管理者在将草坪草保持在用户所期望的质量标准方面面临着许多问题。虽然问题很多，但与病害有关(包括由真菌病原体引起的病害)的那些问题对管理和控制特别具有挑战性。例如，病害可以影响高尔夫球场上的草坪草植物，从而引起由质量降低(包括可玩性)造成的收入损失。对于高尔夫球场管理者而言，常见问题的一个实例是知道存在哪种病害，以便可以采取适当的和及时的管理技术。草坪病原性微生物引起的草坪病害包括例如炭疽病、全蚀病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病(pythium blight)、褐斑病、币斑病(dollar spot)等。

用于控制病原体的农业活性化学品，例如杀真菌剂，通常根据病害压力的程度、病原体群体、天气等需要施用于高尔夫球场。然而，杀真菌剂的施用受球场预算、适当设备可用性、以及施用农业活性化学品的合格人员的可用性高度控制。

考虑到这些问题，建立快速且可靠的草坪病原性真菌检测方法将是非常有用的。已知的PCR测定对于高尔夫球场或其他集中管理的草坪草或专业景观环境没有实用意义，因为PCR需要专业的实验室技能和仪器。例如，在WO 2009147017中已知并描述了用于检测草坪草中真菌病害的某些其他分子生物学方法，其涉及TRFLP方法。

因此，本发明涉及用于检测草坪样品中DNA的存在的LAMP测定，该DNA与引起相关草坪病害的选择的真菌病原体相关联，这些草坪病害包括例如炭疽病、全蚀病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病、褐斑病和币斑病。

为了便于及时地和有效检测草坪草病害病原体，并提高草坪草病害治疗的成本和的有效性，根据本发明的LAMP测定可用于早期检测与引起相关草坪病害的真菌病原体相关联的DNA。根据本发明，LAMP方法适合使用衍生自靶病害病原体的至少四个且优选地六个或更多个核酸序列的引物组。更特别地，本发明方法提供了：用于LAMP测定选择的引物组中使用的每个引物具有15个到50个核酸，并且其中该组中的引物选自靶标真菌内的特定DNA基因座。