[发明专利]用于分析解离解链曲线数据的方法

说明书

本发明涉及使用小波转换来分析核酸的原始解链曲线数据。效果是敏感计算中减少的噪声和提高的计算效率和速度。本发明特别适合于对测试样品进行分类，所述分类涉及在产生大型原始数据集的一个实验中组合分析多个多重检测靶标，其需要区分数据中的微小变化。

发明领域

本申请总体上涉及核酸分析领域。更具体地，它适用于允许解链曲线原始数据的分析和靶核酸信息的可靠解释的方法和系统。

背景

人们对开发用于分析核酸例如基因组DNA的分子技术有着极大的兴趣。核酸扩增方法广泛用于基因组分析，并允许进行定量分析以确定核酸拷贝数、样品来源定量和基因表达的转录分析。

定量分析包括高分辨率解链(high-resolution melting/melt，HRM)曲线分析，其一种多功能工具，用于区分真实扩增产物与人工产物，用于基因分型和用于变体扫描，特别适用于检测小规模变体例如简单的序列重复序列或单碱基变化以及在进行核酸扩增之前提供有限数量或一组具有高丰度的分子的时候(Reed等人,2007；Wittwer等人,2009；Liao等人,2013；Ramezanzadeh等人,2016)。解链曲线分析的一个关键特征是解链温度Tm，其是一种特定的双链体中50％的分子已解离的温度。通常，解链曲线分析着重于确定Tm本身或如由专业人士目视鉴定或使用算法诸如信息图、神经网络或涂片检测算法鉴定的Tm位移(Palais等人，2009)。也可以使用反向实验；在该情况下，一个从在高温例如95℃下解离的分子开始，并且一个随着温度逐渐降低而跟随缔合反应。PCR产物的解链特征谱取决于其GC含量、长度、序列和杂合性，并且非常不同的分子可以具有相似的解链温度。因此通常调用解链曲线分析来区分小规模变体。无法仅通过扩增实验来解析这些小规模变体。

尽管已经设计出了更为复杂的方法，但大多数(即便不是全部)现代方法测量在特定波长带上随着温度变化的荧光变化(Gray等人，2011)。可以通过使用在解链过程中共解离的嵌入染料或通过与称为分子信标的特定报道分子的相互作用来获得荧光变化。原始测量需要通过手工或使用计算机程序进行处理，以表征和鉴定所研究的混合物中的各种寡核苷酸。数据处理通常从背景去除开始，然后着眼于鉴定Tm差异或样品曲线与某些参考信号之间的曲线形状差异。通常从一种众所周知的寡核苷酸、从充分表征的寡核苷酸的混合物或者通过从序列信息开始的计算获得参考信号。通常，应用其中计算原始数据的导数曲线的方法。解链曲线的负一阶导数的曲线图使借助由此形成的峰来查明解离温度更容易。存在各种算法来获得导数曲线。还存在几种用于鉴定“显著”峰或峰位移的方法。峰位、峰高以及有时还将峰宽用作进一步分析中的特征。使用傅立叶变换可以容易地分析信号，傅立叶变换是一种在信号处理中功能强大的数学工具，其分析信号中存在哪些频率以及比例如何。

已经描述了核酸的解链曲线分析领域中的方法和优化方法。

EP2241990描述了一种方法，其中将双S形的以下方程式拟合至测量的数据：随后，从该拟合曲线解析地获得导数，并通过确定导数曲线的最大值来获得Tm。

US6106777描述了一种用于单链DNA片段的方法，其中将未知样品的解链曲线与针对已知DNA片段测得的解链曲线的集合进行比较。随后将相对于“未知”曲线具有最小统计误差的已知曲线或曲线组合视为代表该未知样品。

US8068992描述了一种用于使用递减指数的解链曲线背景校正的方法。

EP2695951描述了用于簇的Tm确定的方法，其中Tm通过在负一阶导数曲线中找到峰或对归一化解链曲线应用阈值来确定。

US9273346描述了一种确定捕获样品测量之间的差异的偏差函数的方法，以及描述空白测量运行的预期背景的数学模型。该偏差曲线得到进一步分析。

US201400067345描述了一种方法，其中对测量的数据进行噪声校正、缩放并拟合到低温区域的估计渐近线，最后进行聚类。