[发明专利]评估病毒载体效力的方法

说明书

本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于免疫疗法的T细胞及其方法。另一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。

相关申请的交叉引用

这是专利合作条约下的国际申请，要求享有2018年1月17日提交的美国临时申请序列号62/618,295和2018年1月17日提交的德国申请102018100967.4的权益，其内容是本文通过引用整体并入。

背景

1.技术领域

本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于癌症免疫疗法的T细胞及其方法。一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。另一方面，本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。

2.技术背景

藉由治疗目的用之病毒载体或病毒递送基因的挑战是临床剂型的制备和精确定量。病毒疫苗、使用病毒载体的重组蛋白和病毒抗原的生产都需要量化病毒来不断调整和监测过程，以优化产量并回应不断变化的需求和应用。

病毒滴度测定或病毒定量涉及计数特定体积的病毒数量以确定病毒浓度。传统方法包括病毒噬斑测定(确定病毒样本中噬斑形成单位(pfu)的数量)和组织培养感染剂量(TCID50)或荧光活性感染剂量(FAID50)(测量感染性病毒滴度)。该TCID50测定法可定量杀死50％受感染宿主细胞或在50％接种组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。传统方法通常检测慢且为劳动密集型，并且受到包括测定间高度变异性的限制。

酶联免疫吸附测定(ELISA)是蛋白质测定更现代的演变方法，其利用与酶连接的特异性抗体来检测样本中是否存在未知量的抗原(即病毒)。透过酶将试剂转化为可检测信号的能力来检测和/或定量抗体-抗原结合事件，所述可检测信号可用于计算样本中抗原的浓度。基于使用ELISA的免疫荧光检测法开发了病毒滴度测定的平板测定法，但是，这些方法是用于定量来自病毒样本的蛋白质而不是定量感染性病毒。

流式细胞术或FACS(荧光激活细胞分选术)测定法已用于测量相对较高感染复数(MOI)下感染的细胞培养物中受感染细胞的数量。例如，美国专利号6,248,514描述了使用流式细胞术分析使用特定范围的病毒颗粒浓度和吸附时间感染的细胞产率。美国专利号7,476,507描述了用于测定受圆环病毒感染的宿主动物宿主细胞培养物的病毒滴度的基于FACS的方法。但是，对于许多应用，流式细胞仪器的成本、尺寸和复杂性阻碍了更广泛的使用。

评估逆转录病毒载体滴度的方法通常可分为功能性和非功能性滴定方法。非功能性滴定方法可包括p24抗原ELISA、逆转录酶(RT)活性的评估，以及透过半定量northern印迹、斑点印迹分析或RT-qPCR测定载体制剂中的基因组RNA浓度。有时这些技术高估了功能性载体滴度并存在某些缺点。例如，定量的p24蛋白质库可包括可变数量的游离p24和非功能性载体颗粒的p24。类似地，RNA滴度可评估缺陷颗粒，而RT测定可以证明RT活性。可以透过限制稀释载体后转导细胞并随后评估报告蛋白活性(例如β-半乳糖苷酶阳性细胞)或透过评估抗生素选择后菌落形成单位的数量来确定更准确的功能性滴度。用于量化功能性载体滴度的更广泛和直接的技术可以使用eGFP荧光和荧光激活细胞分选术(FACS)。但是，转基因表达的FACS分析可能仅限于荧光报告蛋白，并且可能无法区分单次或多次整合的细胞。

US20170166866描述了转导原代T淋巴细胞的方法，包括使原代T淋巴细胞与病毒载体(例如慢病毒载体)和是先天免疫系统抑制剂的化合物接触，所述病毒载体含有感染复数(MOI)为1.5-2.5的核酸，从而将核酸转导入T淋巴细胞中。