[发明专利]一种奥马珠单抗疏水性的检测方法

说明书

本发明提供了一种奥马珠单抗疏水性的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：用木瓜蛋白酶将奥马珠单抗酶解为Fab片段和Fc片段；用疏水色谱串联高效液相色谱对所述Fab片段和Fc片段进行分离，根据所述Fab片段的谱图分析得到奥马珠单抗的疏水性。本发明提供的检测方法检测时间适宜，35‑37min即可完成检测，Fab片段和Fc片段的出峰时间适宜，各峰的分离度高，该检测方法具有较高的专属性、准确度及精密度，方法稳定可行。

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种奥马珠单抗疏水性的检测方法。

背景技术

奥马珠单抗(Xolair)是选择性结合人类免疫球蛋白E(IgE)的一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，具有约149kD的分子量。奥马珠单抗目前适用于治疗皮肤测试呈阳性或在体外对长期气源性致敏原具有反应性且具有吸入性皮质类固醇不充分控制的症状的患者中的中度至重度持久性哮喘。是全球首个批准治疗中至重度哮喘的靶向治疗药物，该产品于2003年首次在全球上市，已在96个国家获得批准，包括美国、欧盟、日本等。

用奥马珠单抗的问题在于：1)其在药学相关剂量下靶向游离IgE，但不靶向(或不能有效靶向)IgE/FcεRI复合物的致病性种类；2)可能由于IgE/FcεRI复合物的的致病性种类不被靶向；3)其不应当用于具有高IgE水平的患者(例如，因为IgE/FcεRI复合物的致病性种类不被靶向，且鉴于患者中的高游离IgE水平而不会随时间耗散)；4)“当服用奥马珠单抗时可以发生I型局部或全身反应，包括过敏反应和过敏性休克”；5)其对IgE的亲和力并不是特别好。

奥马珠单抗Fab片段的修饰不同会影响其疏水性，进而会影响奥马珠单抗的结合活性。故开发适宜的检测方法，检测奥马珠单抗的疏水性能具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种奥马珠单抗疏水性的检测方法。该检测方法稳定可行，具有较高的专属性和准确度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种奥马珠单抗疏水性的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)用木瓜蛋白酶将奥马珠单抗酶解为Fab片段和Fc片段；

(2)用疏水色谱串联高效液相色谱对所述Fab片段和Fc片段进行分离，根据所述Fab片段的谱图分析得到Fab片段的疏水性分布，进而得到奥马珠单抗的疏水性。

疏水色谱(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用样品中蛋白质组分具有不同的疏水作用的性质进行分离的方法。在高盐环境下(初始色谱条件)，被分离蛋白质组分分子表面的疏水微区、(可逆)变性后暴露出的疏水残基，与色谱柱填料(固定相)表面的疏水基团作用而被保留。当流动相的离子强度逐渐降低时，洗脱能力逐渐增强，蛋白质分子按其疏水性由小到大依次流出，从而达到分离目的。

本发明使用木瓜蛋白酶(Papain)将奥马珠单抗(Xolair)酶解为Fab及Fc片段，利用不同组分疏水性质不同，使用疏水色谱串联高效液相色谱(HIC-HPLC)实现分离。Fab不同修饰，如：天冬氨酸残基异构化及未配对二硫键，会导致Fab片段疏水性不同，进而影响奥马珠单抗(Xolair)结合活性。对Fab片段的出峰时间(保留时间)和峰积分面积进行分析即可得知奥马珠单抗的疏水性。

作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述木瓜蛋白酶与所述奥马珠单抗的质量比为(0.5-2):100，例如可以是0.5:100、0.6:100、0.8:100、1:100、1.2:100、1.3:100、1.5:100、1.6:100、1.8:100或2:100等；进一步优选为1:100。