[发明专利]一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法

说明书

本发明公开了一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明所述方法中使用的Co²⁺内稳态系统是通过引入外排蛋白RcnA和摄取蛋白NiCoT构建而成的。在人工Co²⁺内稳态的帮助下，大肠杆菌对于高浓度的Co²⁺耐受性增强，同时使用型诱导系统表达外源基因时，蛋白可被更低浓度的Co²⁺有效诱导。将该系统应用于腈水合酶生产时，达到最大酶活的Co²⁺使用量从500μM降低至300μM，在腈水合酶的酶活和产量不变的基础上，可以显著降低Co²⁺的使用量，降低了生产成本，减少了生产过程中对环境的潜在污染。

技术领域

本发明涉及一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

腈水合酶是一种金属酶，能够催化腈类物质生成酰胺类物质，在工业生产上主要用于丙烯酰胺和烟酰胺的生产。腈水合酶可由其活性中心所含金属离子的不同分为钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。目前腈水合酶已经在大肠杆菌中成功高效表达并扩大于工业应用。大肠杆菌生长速度快、易于培养、发酵工艺简单、蛋白表达量高，这些特点使得利用大肠杆菌生产腈水合酶可以显著提高其产量，并降低生产成本。在使用大肠杆菌生产钴型腈水合酶时，常用IPTG作为诱导剂，并添加Co²⁺作为腈水合酶活性配体。之前已经开发出使用Co²⁺作为诱导剂的基因表达系统，并将其应用于腈水合酶生产中。在该系统中，Co²⁺既作为基因表达的诱导剂，又作为金属配体，从而不需要额外添加诱导剂，降低生产成本的同时也简化了生产工艺。但是，钴是一种较为昂贵的金属，也是重要的化工产品如耐热合金、硬质合金、防腐合金、磁性合金和各种钴盐的重要原料。另外，钴也具有一定毒性，泄露到自然界的钴可造成环境污染，具有潜在的生物危害。

大肠杆菌通过Co²⁺的内稳态系统调节细胞内Co²⁺含量。该系统主要由两部分组成，Co²⁺的摄取系统和外排系统。大肠杆菌没有特异性摄取Co²⁺的转运蛋白，而是通过金属离子通用的转运系统对包含Co²⁺在内的多种金属离子进行摄取。然而，大肠杆菌含有负责Co²⁺和镍离子外排的转运蛋白RcnA，可以主动排除细胞内多余的Co²⁺。人工改造金属内稳态系统，可以改变细胞内的金属离子浓度，从而实现一些特定功能。例如，已经有人通过在大肠杆菌中引入钴镍摄取蛋白增加大肠杆菌对环境中Co²⁺和镍离子的摄取，从而将其开发为净化器以吸附污染水中的Co²⁺和Ni²⁺。然而，不过该研究的目的是增强大肠杆菌对污水中Co²⁺和Ni²⁺的富集，只提高了大肠杆菌对Co²⁺和Ni²⁺的摄取能力，并没有考虑大肠杆菌对Co²⁺和Ni²⁺的排出能力。大肠杆菌高效表达腈水合酶的过程中，腈水合酶需要结合被大肠杆菌摄取到胞内的Co²⁺，才能形成具有活性的酶。而细胞内Co²⁺浓度直接决定了腈水合酶结合Co²⁺的能力，从而影响活性腈水合酶最终的产量。因此，提供一种改造大肠杆菌钴内稳态系统的方法，有助于腈水合酶对Co²⁺的结合，降低生产过程中Co²⁺的使用量，降低生产成本，减少Co²⁺对环境的潜在危害。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组质粒，是将编码Co²⁺摄取蛋白NiCoT和Co²⁺外排蛋白RcnA的基因单独或共同构建至质粒当中，并利用RBS调节NiCoT和/或RcnA的表达强度。

在本发明的一种实施方式中，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。