[发明专利]一种改造钴内稳态减少腈水合酶生产中钴用量的方法有效
| 申请号： | 201911421812.2 | 申请日： | 2019-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN111019964B | 公开（公告）日： | 2021-12-28 |
| 发明（设计）人： | 周哲敏;崔文璟;韩来闯;周丽;刘中美;郭军玲;程中一 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12N9/88;C12R1/19 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 仇钰莹 |
| 地址： | 214000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 改造 稳态 减少 水合 生产 用量 方法 | ||
1.一种重组质粒，其特征在于，将编码Co2+摄取蛋白NiCoT和Co2+外排蛋白RcnA的基因单独或共同构建至质粒当中，并利用RBS调节NiCoT和/或RcnA的表达强度；所述质粒是将钴离子响应的阻遏蛋白RcnR、受阻遏蛋白RcnR调控的启动子与pET28a(+)载体连接得到的；所述受阻遏蛋白RcnR调控的启动子是将阻遏蛋白RcnR的操纵序列rcnO连接到启动子Pveg下游构建得到的；编码所述阻遏蛋白RcnR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述操纵序列rcnO的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述启动子Pveg的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述NiCoT的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述RcnA的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组质粒，其特征在于，用核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的RBSstrong调节NiCoT的表达强度，用核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的RBSweak调节RcnA的表达强度。
5.表达权利要求1-4任一所述重组质粒的大肠杆菌。
6.权利要求5所述的大肠杆菌在生产腈水合酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用具体是将权利要求1-4任一所述述重组质粒转入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；挑取重组大肠杆菌单菌落在LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养8-14 h；之后按1-5%接种量转入LB培养基中200-220rpm，35-39℃培养；加入钴离子诱导剂后，温度降低至20-25℃进行蛋白表达。
8.权利要求5所述的大肠杆菌在环保领域中的应用。
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