[发明专利]一种DNA聚合酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种DNA聚合酶，其特征在于，如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述的DNA聚合酶的基因，其特征在于，如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的基因；

所述表达载体带有组氨酸标签；

所述表达载体为pBAD。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.一种分泌DNA聚合酶的宿主细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）构建如权利要求3所述的表达载体；

（2）将步骤（1）所述的表达载体转化到宿主细胞，得到所述分泌DNA聚合酶的宿主细胞。

7.一种如权利要求1所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1’）构建如权利要求4所述的宿主细胞，并对所述宿主细胞进行诱导培养；

（2’）收集诱导培养后的宿主细胞，进行裂解、离心，得到上清液；

（3’）对上清液进行纯化，得到所述DNA聚合酶。

8.根据权利要求7所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤（1’）所述的诱导培养采用诱导剂进行；

所述诱导剂为阿拉伯糖；

所述诱导剂的终浓度为0.1%~0.3%；

步骤（1’）所述诱导培养的温度为20~30℃；

步骤（1’）所述诱导培养的时间为12~16 h；

步骤（2’）所述裂解包括采用裂解液重悬宿主细胞，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70~80℃中水浴10~20 min；

所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2~10):1。

9.根据权利要求7所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1’）构建如权利要求4所述的宿主细胞，对所述宿主细胞采用0.1%~0.3%的阿拉伯糖、在20~30℃下诱导培养12~16 h；

（2’）收集诱导培养后的宿主细胞，采用裂解液进行重悬，所述裂解液与所述宿主细胞的质量比为(2~10):1，采用细胞破碎仪对重悬液进行破碎，在70~80℃中水浴10~20 min，离心后收集上清；

（3’）对上清液依次进行Ni亲和层析、肝素亲和层析和阳离子交换层析，具体为：

（1’’）将Ni层析介质和上清液的混合物加入Ni亲和柱，采用浓度梯度为30~400 mM的咪唑溶液洗涤，收集Ni亲和洗脱液；

（2’’）将Ni亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(3-5)混合，加入肝素亲和柱，采用浓度梯度为50 mM~1 M的KCl溶液洗涤，收集肝素亲和洗脱液；

（3’’）将肝素亲和洗脱液和缓冲液按体积比为1:(2-5)混合，加入阳离子交换柱，采用浓度梯度为50 mM~1 M的KCl溶液洗涤，收集阳离子交换洗脱液；

（4’’）将阳离子交换洗脱液加入透析缓冲液中进行透析，得到纯化的DNA聚合酶。

10.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的DNA聚合酶；

所述酶制剂还包括酶缓冲液。

11.一种如权利要求1所述的DNA聚合酶、如权利要求3所述的表达载体、如权利要求4所述的宿主细胞或如权利要求10所述的酶制剂在制备分子检测试剂盒中的应用。