[发明专利]一种DNA聚合酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述DNA聚合酶具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有DNA聚合酶的活性。本发明的Deep Sea DNA聚合酶去除了野生型DNA聚合酶的部分3’→5’核酸外切酶校读活性，具有比Taq酶高5倍的保真度，稳定性好、活性高，适用于含有高GC序列和循环序列的困难模板的扩增，可以作为三代测序建库的工具酶。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

DNA聚合酶，是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类DNA依赖型酶，最早由美国科学家Arthur Komberg于1957年在大肠杆菌中发现的，在此之后，多种DNA聚合酶陆续在其他原核生物和真核生物中被发现。DNA聚合酶种类繁多，功能各异，研究人员通常需要根据实际应用合理选择DNA聚合酶的种类，随着基因组学发展，具有5'→3'扩增活性的热稳定DNA聚合酶在分子领域得到广泛的应用。

1992年，在加利福尼亚湾深海火山口2010米处发现了一株能在104℃环境中生长的热球菌GB-D，并从该菌株的产物中分离纯化得到了高保真的耐热野生型Deep Sea DNA聚合酶。该野生型Deep Sea DNA聚合酶基因全长约2295个碱基，编码765个氨基酸，分子量为89kDa左右，具有3'→5'核酸外切酶校读活性，热稳定性强，在100℃的半衰期是8h，在95℃的半衰期是23h。

目前市面上常见的DNA聚合酶普遍存在热稳定性差、保真性低、纯度较低的问题，对于困难模板的扩增效果较差，无法满足三代测序的要求。

CN 101255435 A公开了耐热性DNA聚合酶(Bcady-pol)基因及其编码蛋白的应用，采用Ni离子柱进行纯化，得到的蛋白纯度仍然无法满足三代测序的要求。

CN 104560908 A公开了一种重组大肠杆菌Taq DNA聚合酶的纯化方法，包括以下步骤：(1)破菌；(2)热处理；(3)盐析；(4)Ni离子金属螯合亲和层析；(5)透析；(6)制剂分装。然而该方法得到的Taq DNA聚合酶的热稳定性较差。

CN 108265039 A公开了一种突变Taq DNA聚合酶及其纯化方法，将天然Taq DNA聚合酶进行突变，去除了其5’-3’的DNA外切酶活性，并且引入E507R，E742A和A743H(氨基酸位置根据野生型Taq DNA聚合酶所定)突变。然而所述Taq DNA聚合酶的热稳定性较差。

基于此，有必要提供一种热稳定性好、纯度高、保真性好的DNA聚合酶及其表达纯化方法，应用于测序技术领域。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述DNA聚合酶热稳定性好、纯度高，可以应用于三代测序中。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种DNA聚合酶，具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中任意一个：

(I)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有≥98％同源性的多肽；

(III)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过1～20个氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有DNA聚合酶的活性；

所述SEQ ID NO:1的氨基酸序列为：