[发明专利]一种基于全基因组测序技术的多种动物源性掺假鉴别方法

说明书

本发明公开了一种基于全基因组测序技术的多种动物源性掺假鉴别方法，包括如下步骤：1)构建线粒体基因组数据库，将测序数据与线粒体基因组数据库进行比对，提取比对得到的线粒体序列；2)将1)中提取的线粒体序列进行各物种线粒体基因组重组装；3)将1)中提取的线粒体序列比对到2)中重组装的线粒体基因组上，提取比对到2)中重组装线粒体基因组上的序列；4)将3)中比对到重组装线粒体基因组上的序列分为2类，提取只比对到单一物种重组装线粒体基因组的序列，根据序列数量分析混合物的物种组成。本发明方法可以定性和定量地测定复杂肉样中多种生物成分的含量，在食品和制药工业中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，更具体的说是涉及一种混合肉样定性和定量分析的方法。

背景技术

肉类是人们日常消费的重要组成部分，然而，许多商家通过在昂贵的牛肉和羊肉中掺入廉价的鸡、鸭、水貂或其他动物肉以赚取高额利润，损害了消费者的权益，扰乱了市场秩序。因此，鉴别肉及肉制品中的掺假成分是非常重要的。目前，实时PCR技术是肉类鉴定的主流技术，但它只能检测单个品种，即检测出被检测品种的存在与否，不能在定性、定量的同时测定混合肉样的多种生物成分(Multiple Components，MTCs)的来源。

随着下一代DNA测序技术的普遍使用，已经开发出宏DNA条形码(metabarcoding)方法使用特定标记的PCR扩增进行物种测定。所有序列(reads)都可以比对到整个核基因组，用于物种测定和量化。然而宏DNA条形码分析的主要方法仍然是标准的PCR扩增依赖法，其局限性在于：需要针对特定标记的通用引物，即使对于同一个标记，在所有分类群中通常也缺乏这种通用引物。当不同的标记用于不同的设置，甚至当不同的引物对用于相同的标记时，使用不同的通用标记和引物会增加数据整合的复杂性。其次，即使在通用引物存在的情况下，不同序列的模板DNA分子具有不同的解链温度，将导致扩增偏倚。因此，不同序列的模板DNA分子很难直接定量。

因此，如何提供一种简单、准确、通用的从复杂肉样中鉴定多个生物成分的方法是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种基于全基因组测序技术的多种动物源性掺假鉴别的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于全基因组测序技术的多种动物源性掺假鉴别方法，包括如下步骤：

1)根据已知线粒体基因组构建线粒体基因组数据库，对样本进行DNA提取和测序，将测序数据与线粒体基因组数据库进行比对，提取比对得到的线粒体序列；

2)以已知各动物物种线粒体基因组序列为参考序列，将1)中提取的线粒体序列进行各物种线粒体基因组重组装；

3)将1)中提取的线粒体序列比对到2)中重组装的线粒体基因组上，提取比对到2)中重组装线粒体基因组上的序列；

4)将3)中比对到重组装线粒体基因组上的序列分为2类：只比对到单一物种重组装线粒体基因组的序列，比对到多个物种重组装线粒体基因组的序列；提取只比对到单一物种重组装线粒体基因组的序列，根据序列数量分析混合物的物种组成。

使用上述Mitobarcoding方法的优点：1.避免了寻找通用引物和通用条形码的问题；2.不会过度放大污染微生物，从而能够准确测定多种生物成分(Multiple Components，MTCs)的含量；3.将测序偏差的影响降到最低；4.装配误差最小化；5.与使用特定类型标记的分析结果一致。

优选地，已知线粒体基因组可根据已公开的线粒体基因组不断进行完善，以便适用于更多物种的鉴定。截止到2019年2月，NCBI RefSeq数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen ome/browse)已收集到8000多个动物线粒体基因组。

优选地，1)中：