[发明专利]一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以酿酒酵母BY4741背景下的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过不同的linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上。而经过融合表达后，在相同的发酵条件下，Bga‑L12工程菌产量最高达1.45g/L，较没有进行MIOX4和udh融合表达的酿酒酵母工程菌其产量提高了近5倍。为葡萄糖二酸工程菌的进一步代谢改造奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡糖二酸(Glucaric acid)，是葡萄糖的醛基和C6位羟基皆被氧化为羧基而形成的二元酸。自然界中即存在葡糖二酸，如十字花科的素菜(花椰菜等)、水果(如柑橘等)以及哺乳动物的代谢物中均发现葡糖二酸。葡糖二酸及其衍生物在医药方面有重要的应用，由于葡糖二酸及其内酯可以有效抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性，因此成为良好的抗癌物质。而且，葡糖二酸还具有降低胆固醇的作用；葡糖二酸-1,4-内酯具有抗氧化作用，能够抑制糖尿病。研究发现，葡糖二酸可以通过缩聚反应形成聚酰胺，该聚合物具有生物可降解性，开拓了可降解尼龙材料的发展前景。

酿酒酵母相较于大肠杆菌，具有更高的工业应用价值，一方面酿酒酵母的耐酸能力强于大肠杆菌，另一方面酿酒酵母本身可以作为单细胞蛋白用于饲料、食品等。酿酒酵母还具有其它优点，如耐低温、可低pH发酵、没有噬菌体感染、适合大规模发酵、易分离和高抗逆性等特点。因而酿酒酵母已经广泛用于产有机酸的研究，如ρ-羟基苯甲酸、ρ-氨基苯甲酸、ρ-羟基苯丙烯酸和青蒿酸等。通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸具有2个优势，一是细胞本身含有葡糖糖二酸合成途径中的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1，二是酵母能够利用葡萄糖-6-磷酸合成肌醇。目前对于通过酿酒酵母代谢工程制备葡萄糖二酸研究的相关报道比较少，Prather课题组将外源MIOX和UDH基因引入酿酒酵母细胞进行异源表达实现了通过葡萄糖和外加肌醇在酿酒酵母细胞中产葡萄糖二酸，但是其产量在上罐培养条件下只有1.6g/L。我们前期酿酒酵母工程菌Bga-001在分批补料发酵条件下能够产6g/L的葡萄糖二酸。

通过代谢工程策略构建的途径含有异源酶时，由于异源蛋白缺少宿主细胞天然代谢调控机制，因此，宿主细胞流量存在不平衡的问题。脚手架蛋白被用来募集代谢途径酶进行融合表达，该方法可以减少底物流失和中间代谢物的积累，提高途径合成效率，因此近年来成为研究的热点。在大肠杆菌中，通过构建脚手架蛋白葡糖二酸的产量可以提高3倍。在酿酒酵母中，通过亲合体和脚手架构建融合蛋白将法尼基二磷酸合成酶和法尼烯合成酶进行共定位，法尼烯的产量提高了135％；将这种方法应用于大肠杆菌聚羟基丁酸酯(PHB)的合成后，PHB的产量提高了7倍。本发明拟通过构建亲合体脚手架将拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过不同的linker连接，提高MIOX1和udh的途径效率，在此基础上进一步提高葡糖二酸合成途径的效率，从而为进一步的代谢改造奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种提高提高酿酒酵母工程菌株合成葡萄糖二酸效率的方法。本发明通过以下方案来实现：

本发明的第一个目的是提高一种合成D-葡萄糖二酸的酿酒酵母基因工程菌，是以酿酒酵母BY4741的opi1缺失株为出发菌株，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的肌醇加氧酶MIOX4和丁香假单胞菌来源的糖醛酸脱氢酶udh通过linker连接，然后整合至酿酒酵母opi1缺失株的基因组上。

在一种实施方式中，所述肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述糖醛酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。