[发明专利]基于重组皮肤模型的光致敏性评价方法

说明书

本发明提供一种基于重组皮肤模型的光致敏性评价方法，所述方法包括以下步骤：S1.复苏重组皮肤模型；S2.涂抹受试物；S3.清洗受试物；S4.选取光源；S5.评价光致敏性；其中，所述评价光致敏性包括：利用双末端测序法分析全基因组，通过与未照射组比较致敏相关基因上调个数来评价受试物的光致敏性。本发明基于重组皮肤模型的光致敏性评价方法，不仅能够检测容易分散的化学品，还能检测不分散的化学品及化妆品成品。

技术领域

本发明属于皮肤光致敏性评价和研究技术领域，具体涉及一种基于重组皮肤模型的光致敏性评价方法。

背景技术

光致敏性是光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应，临床表现为组织损伤、细胞变性坏死炎症反应、产生表皮炎症如红斑、水肿及丘疹等，有扩散性和反应持久性，一般无色素沉着，患者会感觉瘙痒和疼痛，严重者会引起全身症状。卤化水杨酰苯胺、氯丙嗪、奎尼丁、非甾体抗炎类(最常见的是酮洛芬)、磺胺类药物等具有光致敏性，化妆品中也存在许多光致敏性物质，这些物质通过皮肤接触、口服、注射等途径进入体内，在光线照射后会引起光致敏性反应。

皮肤光致敏反应的有害结局路径(AOP)由四个关键事件组成：(1)起始事件：在光照条件下，光致敏物与皮肤内的蛋白形成具有免疫原性的半抗原-蛋白结合物；(2)角质形成细胞反应事件：角质细胞发生炎性反应并启动特定细胞通路基因表达(例如抗氧化/亲电子剂反应元件依赖型通路)，角质形成细胞反应事件的主要目的是促进朗格汉斯细胞捕获抗原以及发生迁移；(3)树突状细胞反应事件：在角质细胞(keratinocyte，KC)提供的危险信号下，皮肤内的朗格汉斯细胞(langerhans cell，LCs)捕获抗原，LCs在光致敏性的诱导阶段发挥着重要的作用；(4)T细胞反应事件：LCs细胞被激活后移行至局部淋巴结，将抗原呈递给初始T细胞，促使其活化和增殖分化，最终诱导记忆T细胞、辅助性T细胞(T helpercell，Th细胞)和细胞毒性T细胞(T cytotoxic cell，Tc细胞)的产生，完成光致敏作用的诱导过程。当人体再次接触相同或有交叉反应的光致敏物时，局部淋巴结的记忆T细胞会迅速活化，从而激发特异性的细胞免疫应答。Tc细胞通过释放穿孔素和蛋白酶，直接破坏抗原特异性的靶细胞，引起组织坏死。Th细胞则可通过释放IFN-γ，IL-2，IL-8等细胞因子、炎症因子，激活巨噬细胞和自然杀伤细胞(natural killercell，NK)，引起单个核细胞浸润为主的组织损伤，完成光致敏作用的激发过程。

对于光致敏性的评价方法，传统的方法主要采用动物实验。(1)豚鼠光致敏试验，豚鼠光致敏试验方法的优点在于可以完整地模拟人的光致敏反应过程，灵敏度和准确度较高，但该方法存在以下缺点:使用动物数量多、试验周期长，对动物损伤大，不符合动物福利及3R原则，仅能通过肉眼观察并打分进行评价，评价结果易受试验者主观因素和水平的影响，缺乏客观定量的评价指标，并且无法对有色化合物的光致敏性进行评价等；(2)光照条件下小鼠局部淋巴结试验：与传统的豚鼠光致敏试验相比，光照条件下局部淋巴结试验优势在于具有客观的评价指标，使用动物数减少，试验周期缩短，并且可以评价有色受试物，但是通过在诱导期检测受试物引起局部淋巴结增殖进行光致敏性评价，光刺激剂可能会出现假阳性结果；从而使这些方法特异性受到一定影响。

目前光致敏体外评价方法，比如：以角质细胞(keratinocyte，KC)为光致敏模型的体外评价方法；以树突状细胞为模型的体外评价方法；基于人类细胞系激活试验(humancell lineactivation test，h-CLAT)评价方法。这几种方法一方面都处于验证阶段，另一方面，这些方法最大的一个弊端是都基于细胞水平所开展的检测，而对于不容易分散的化学品及化妆品成品不适用。

Epikutis是以中国人皮肤组织分离出的角质形成细胞为种子细胞，经专利技术构建而成的3D重组表皮模型。Epikutis重组人表皮模型具有完整的表皮结构：基底层、棘层、颗粒层、角质层，与人表皮结构高度类似，而且是国内首款产业化的3D皮肤模型。