[发明专利]一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶的生产工艺

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶的生产工艺，固体发酵通过菌种的筛选，正常酶活力可做到7万U/g以上，通过工艺设计优化，参数调整，最终产出酸性蛋白酶酶活力达到8‑10万U/g。通过菌种优化缩短发酵周期、通过工艺优化(浅盘发酵)杂菌率降低2‑3个数量级(100‑1000倍)，既保障了产品质量，又极大降低了生产成本，更适用于工业化生产要求。同时固体发酵酸性蛋白酶带培养基一块粉碎包装销售，利用率高，无废弃料、下脚料，做到100％全利用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶的生产工艺。

背景技术

酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000—40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶。根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。

国外关于酸性蛋白酶的研究和生产从20世纪初就开始了。乞今为止，已发现不少微生物可以产生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突变株(A.niger var.macrosporus)、斋藤曲霉(A.saitoi)、宇佐美曲霉(A.usamii)、泡盛酒曲霉(A.awamori)、微紫青霉(Pen.janthinellum)、根霉(Rhizopus sp.)等。1903年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的柔制。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外开始对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。到目前为止，国外科学家对酸性蛋白酶的结构和功能等已经进行了广泛系统的研究。

我国从上世纪60年代就开始微生物产酸性蛋白酶相关研究生产，早期生产的微生物酸性蛋白酶，只是工业级的，主要用于皮毛软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析、板框压滤、气流(沸腾)干燥、粉碎、化验、包装制成工业级酸性蛋白酶。近年来国内在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种。目前国内生产酸性蛋白酶的厂家用酸性蛋白酶生产的菌种主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它们突变株，存在酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂，微生物指标不稳定，生产成本高等问题。

发明内容

针对以上情况与行业现状，申请人通过大量的菌种选育、工艺设计优化，发明出一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶的生产工艺，固体发酵相较传统的液体发酵，伴生酶系更加全，使用效果好，更受市场青睐，同时克服了普通固体发酵工艺成熟度低，杂菌率高，酶活力低的难题。

本发明所述的一种黑曲霉固态发酵生产酸性蛋白酶的生产工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)试管斜面菌种制备：

斜面培养基包括蔗糖3％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁：0.05％氯化钾0.05％、硫酸亚铁0.01％、琼脂2％，调节Ph6.0～6.2，电炉上加热煮沸充分溶解，用玻璃移液管吸培养基分装到的玻璃试管中，塞好棉塞，用纸包好，在121℃、0.1Mpa条件下灭菌30min，灭菌完成后试管倾斜置于超净台内，冷却凝固，斜面占试管长度的2/3，将黑曲霉菌株接种到试管斜面培养基进行培养；

(2)摇瓶菌种制备：

摇瓶培养基包括葡萄糖4％、酵母粉0.3％、豆饼粉1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.02％，控制Ph5.5～6.0，在121℃、0.1Mpa条件下灭菌30min，冷却，斜面试管接种于摇瓶中进行培养；

(3)种子罐菌种扩繁：