[发明专利]一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法

说明书

一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，包括将中药单体加入至评价菌液，孵育12h后用无菌PBS洗涤一次，再用无菌PBS配制的质量分数为2%的BSA封闭1小时，再然后用无菌PBS洗涤一次；接下来加入100ul的β‑葡聚糖抗体，放在4°C冰箱进行染色4h，染色结束后，用无菌PBS洗涤2次，再用cy3单抗鼠标记IgG在室温下避光染色1小时，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用1ml的无菌PBS进行避光重悬，避光震荡混匀后用流式细胞仪进行葡聚糖荧光暴露强度的检测；或者用流式细胞仪进行几丁质荧光暴露强度的检测；或者用倒置荧光显微镜记录β‑葡聚糖与几丁质荧光图像。本发明利用白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用，具有临床意义。

技术领域

本发明涉及一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法。

背景技术

白色念珠菌为常见的条件致病性真菌，属于酵母科念珠菌属。白色念珠菌是在念珠菌属中发病率和死亡率排名第一的一种念珠菌。白念珠菌的耐药性主要来自长期/重复用药和/或内部生物膜的形成。它可以引起浅表的紊乱，也可以引发深层的入侵。但随着传统抗真菌药物的长期使用, 临床出现越来越严重的菌株耐药，这已经严重危害患者的生命安全。

白色念珠菌细胞壁由β-葡聚糖、甘露糖蛋白和少量的壳多糖(几丁质)组成。白念珠菌的细胞壁蛋白参与白念珠菌的黏附和侵入。细胞壁是白念珠菌最外层结构，完整的细胞壁呈刚性结构，可以作为物理化学屏障保护细胞，并可以调节营养物质的吸收和代谢产物的分泌。白念珠菌感染时，正是通过其细胞壁的主要组分与宿主细胞上相应受体的相互作用介导对靶细胞的损伤。因此，研究针对细胞壁的抗白念珠菌药物对于防治白念珠菌感染具有重要意义。

白念珠菌细胞壁作为第一个接触点，是一个动态的、高度构成的细胞器，也是最早感知和响应由药物攻击引起的环境线索的部位。在大量的病原体分子模式(PAMP时)共价链接到细胞壁，β-1,3-glucan通常是被埋在外层由连接有N-/O-的甘露糖基化和磷酸化的甘露糖基化装饰的糖基化的甘露糖蛋白下面。当感知外部刺激(如药物攻击),内部β-葡聚糖将会被暴露,这个过程叫做细胞壁重塑/重排(CWR)，随后激活固有免疫防御。通过白色念珠菌细胞壁重构这种方法来评价药物抗真菌作用效果是具有一定的可行性和临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，包括下列步骤：

步骤1：对保存的白色念珠菌株进行活化培养培养12-16h，直至白色念珠菌株达到指数生长阶段，然后离心后收集真菌细胞，用PBS洗涤后，将白色念珠菌株细胞在RPMI-1640培养基中复苏，然后调节RPMI-1640培养基pH值为7.5，并将白色念珠菌株细胞的浓度调节至1×10³CFU/mL，得到评价菌液；

步骤2：将中药单体加入至评价菌液，孵育12h后用无菌PBS洗涤一次，再用无菌PBS配制的质量分数为2% 的BSA封闭1小时，再然后用无菌PBS 洗涤一次；接下来加入100ul的β-葡聚糖抗体，放在4°C冰箱进行染色4h，染色结束后，用无菌PBS洗涤2次，再用cy3单抗鼠标记IgG在室温下避光染色1小时，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用1ml的无菌PBS进行避光重悬，避光震荡混匀后用流式细胞仪进行葡聚糖荧光暴露强度的检测；

步骤3：将100ul的浓度为100μg/mL的荧光染料Alexa Fluor 488 conjugated WGA、评价菌液和中药单体混合，孵育12h，然后放到37°C摇床中进行避光摇晃15分钟，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用流式细胞仪进行几丁质荧光暴露强度的检测；