[发明专利]一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法在审
| 申请号： | 201911407233.2 | 申请日： | 2019-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN111707815A | 公开（公告）日： | 2020-09-25 |
| 发明（设计）人： | 邵菁;刘娟娟;李倩倩;潘敏;陈梦丽;汪天明;吴大强;马克龙;颜贵明;汪长中 | 申请（专利权）人： | 安徽中医药大学 |
| 主分类号： | G01N33/50 | 分类号： | G01N33/50 |
| 代理公司： | 苏州翔远专利代理事务所(普通合伙) 32251 | 代理人： | 王华 |
| 地址： | 230000 *** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 通过 白色 念珠菌 细胞壁 重构来 评价 中药 单体 真菌 作用 方法 | ||
1.一种通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：对保存的白色念珠菌株进行活化培养培养12-16h，直至白色念珠菌株达到指数生长阶段，然后离心后收集真菌细胞，用PBS洗涤后，将白色念珠菌株细胞在RPMI-1640培养基中复苏，然后调节RPMI-1640培养基pH值为7.5，并将白色念珠菌株细胞的浓度调节至1×103CFU/mL，得到评价菌液；
步骤2：将中药单体加入至评价菌液，孵育12h后用无菌PBS洗涤一次，再用无菌PBS配制的质量分数为2% 的BSA封闭1小时，再然后用无菌PBS 洗涤一次；接下来加入100ul的β-葡聚糖抗体，放在4°C冰箱进行染色4h，染色结束后，用无菌PBS洗涤2次，再用cy3单抗鼠标记IgG在室温下避光染色1小时，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用1ml的无菌PBS进行避光重悬，避光震荡混匀后用流式细胞仪进行葡聚糖荧光暴露强度的检测；
步骤3：将100ul的浓度为100μg/mL的荧光染料Alexa Fluor 488 conjugated WGA、评价菌液和中药单体混合，孵育12h，然后放到37°C摇床中进行避光摇晃15分钟，然后用无菌PBS避光洗涤3次后用流式细胞仪进行几丁质荧光暴露强度的检测；
步骤4：用倒置荧光显微镜，选择激发波长488nm和发射波长525nm，将菌液滴在粘附载玻片上，然后盖上粘附盖玻片在倒置荧光显微镜亮场和暗场下记录β-葡聚糖与几丁质荧光图像；用含有抗体的无药菌液做空白对照。
2.根据权利要求1所述的通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，其特征在于：所述中药单体的浓度为最低抑菌浓度。
3.根据权利要求1所述的通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式细胞仪BD Accuri C6的FL1通道，488nm激发波长和520 nm发射波长，白色念珠菌细胞进样5000个测几丁质的荧光暴露强度。
4.根据权利要求1所述的通过白色念珠菌细胞壁重构来评价中药单体抗真菌作用的方法，其特征在于：用流式细胞仪BD Accuri C6的FL2通道，488nm激发波长和570 nm发射波长，白色念珠菌细胞进样5000个测β-葡聚糖的荧光暴露强度。
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