[发明专利]一种重组溶菌酶抗菌肽融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种重组溶菌酶抗菌肽融合蛋白及其制备方法与应用，属于生物基因工程技术领域。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)本发明制备的溶菌酶抗菌肽融合蛋白抗菌活性高，对革兰氏阳性菌金葡球菌、表皮葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均具有明显的抑制作用，抗菌活性明显改善，拓宽了抗菌谱，且无细胞溶血性与动物毒性。(2)本发明采用的纯化制备之所以过程简单是因为采用色谱复性技术，采用本发明的连接肽，能够有效防止复性纯化蛋白的得率和活性明显下降。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组溶菌酶抗菌肽融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

抗生素的滥用导致了大量耐药菌的出现，对人体造成直接威胁，已成为一个世界性难题。在禽畜及水产养殖方面也存在着抗生素滥用的现象，畜牧业使用抗生素的量，已经远远超过人类使用量的总和。食物、动物中抗生素残留及由此产生的这些耐药菌通过食物或动物与人的接触传播给人类，危害人类健康。长期滥用食品防腐剂也会导致耐药菌株的产生，其中不少还有较强致癌的危险，并对骨骼生长，肾脏、肝脏产生危害，直接威胁着人类的健康。因此，寻找高效、安全、无环境污染的抗有害微生物制剂具有重要现实意义。

溶菌酶、抗菌肽等作为新型抗菌剂，具有效果稳定、无残留、不易产生抗药性，并且安全无毒害。作为防腐杀菌剂，将它们用于医药、保健品、兽药以及作为食品、饮料的防腐保鲜剂、饲料添加剂等领域，其应用前景十分广阔，因而受到人们的关注。

溶菌酶是一种天然、高效、较广谱的抗菌剂，能明显抑制革兰氏阳性细菌生长。以往实际使用的溶菌酶来源于天然产物的提取，如鸡卵清溶菌酶、乳酸链球菌肽等，由于原料及制备成本较高，限制了它们的大规模应用。利用基因工程技术进行表达生产将是重要的发展方向。和蛋清溶菌酶相比，人溶菌酶溶菌活性比蛋清溶菌酶高出3倍，且热稳定性也高，具有较强的应用性。基因工程表达的人菌酶已开始进入临床实验。

重组人溶菌酶对革兰氏阳性菌中的金葡球菌、表皮葡萄球菌具有很好的抗菌活性，尤其对甲氧西林耐药的金葡球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌(MRSE)及克拉霉素、罗红霉素等耐药菌均有效，但对革兰氏阴性菌菌中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、枸橼酸杆菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌等的抗菌作用较弱，因而限制了其应用范围，重组溶菌酶的抗菌范围及抗菌活性还有待进一步改进。

抗菌肽是广泛存在于生物体内的具抗微生物活性的小分子多肽，具有热稳定、水溶性好、无残留、不易产生抗药性的特点。大多抗菌肽对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、念珠球菌、绿脓杆菌、肠细菌、沙雷氏菌、变形杆菌、粪链球等革兰氏阴、阳性菌都有抑菌效果，抗菌的广谱性较优于溶菌酶。此外，抗菌肽对人及动物无毒无害，具有很高的安全性。因此，抗菌肽在新型抑菌药物、食品天然防腐剂及动物饲料添加剂等产品开发领域具有广阔的应用前景。

但抗菌肽天然资源有限，化学合成获得抗菌肽成本又较高，由于抗菌肽本身对宿主菌有一定的灭活作用，目前还不能在基因工程菌中直接表达抗菌肽，而是以融合蛋白的形式进行，这无疑给后续加工和使用带来了极大的不方便，并且大大增加了成本。因此，如何利用基因工程技术在微生物中方便、有效及低成本的生产抗菌肽成为其实际应用的关键。

溶菌酶和抗菌肽之间有较强的协同抗菌作用。天然状态下，溶菌酶、β-防御素、LL-37相互协调，可明显抑制葡萄球菌、大肠杆菌的生长，抑菌的效果均远高于两者单独使用的效果。

溶菌酶和抗菌肽是两种优良的天然抗菌剂，但实际应用还有相当的不足。对于前者，在抑菌活力、抑菌范围、稳定性等方面还有待进一步改善。而抗菌肽在性能上可以弥补溶菌酶抑菌范围、稳定性等方面的不足，但还不能在微生物中直接进行表达应用。