[发明专利]一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法

说明书

本发明公开了一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，该方法以植物叶片为材料，通过调整材料类型、材料用量、研磨方式、离心转子类型、蛋白重悬方式等过程，结合差速离心方法，得到了高质量的植物叶片内质网蛋白。采用15天左右的适龄植物叶片，新鲜叶片直接加缓冲液研磨的方式取代液氮研磨后超声提取的方式，并且在12000xg转速离心时以水平转子代替定角转子，纯化后内质网蛋白与总蛋白相比，内质网蛋白阳性标记GRP78和CNX，分别上升了约3.3倍和6.1倍，叶绿体阳性蛋白RCA和细胞核阳性蛋白Histone H3分别下降了约84.1％和74.4％。本发明首次建立一套适用于植物叶片内质网蛋白提取纯化的有效体系，对于其他植物叶片构建内质网蛋白提取纯化体系具有参考意义。

技术领域

本发明涉及一种提取纯化植物叶片内质网及其蛋白的有效方法，适用于植物叶片内质网蛋白的分离纯化，属于植物生物技术领域。

背景技术

内质网是一个连续的膜系统，由滑面内质网和附着有核糖体的粗面内质网组成(Wang et al.,2016)。它的主要功能是参与细胞中蛋白质和脂质的生物合成，也是蛋白质的质量控制中心(Borgese et al.,2006)。现代研究表明在大豆(Wang et al.,2016)、菠菜(Anderson et al.,1994)、拟南芥(Liu et al.,2007)等植物中，内质网都具有重要功能，它能够响应干旱、淹水、寒冷、盐等非生物胁迫，减轻植物受到的伤害。

目前从植物叶片中提取内质网未见报道。前期研究表明，在紫外线B(UVB)胁迫后的桑叶亚细胞结构发生显著变化，蛋白质组学研究表明初生代谢系统和次生代谢系统都受到影响(虞姣姣等，2016)。因此提取高质量桑叶内质网以进行内质网蛋白质组学分析，成为进一步开展植物叶片抗UVB胁迫机制等研究工作的关键。

发明内容

本发明目的是提供一种提取纯化植物叶片内质网及其蛋白的有效方法，用于植物叶片内质网蛋白的分离纯化。

本发明采用以下技术方案实现：

一种从植物叶片中提取纯化内质网及其蛋白的有效方法，具体包括如下步骤：

1.植物叶片的组织破碎

(1)称取适量新鲜植物叶片，用清水洗净擦干，得到可以用于后续实验的干净植物叶片；

(2)取上述组织叶片，将其剪碎为0.2～2.0cm，置预冷的研钵中，每1g叶片加1-5mL预冷的研磨缓冲液和1-10μL 100x的蛋白酶抑制剂，于冰上研磨成匀浆。

2.对上述植物叶片的组织匀浆进行离心分离内质网

(1)取上述植物叶片匀浆，分装于15mL离心管中，在0-10℃条件下以800-1200xg转速离心10-30分钟，细胞碎片和细胞核在沉淀中，收集上清液；

(2)将上述上清液分装至干净并预冷的聚碳酸酯材质的厚壁超速离心管(或同等离心管)，在超速冷冻离心机中，0-10℃条件下以10000-15000xg转速离心10-30分钟，线粒体和叶绿体等细胞器在沉淀中，收集上清液；

(3)将上述上清液分装至干净并预冷的聚碳酸酯材质的厚壁超速离心管(或同等离心管)，在超速冷冻离心机中，在0-10℃条件下以60000-150000xg转速离心30-120分钟，去掉上清液，取沉淀即为内质网。

3.对上述提取的内质网进行裂解提取蛋白

(1)裂解液现用现配，在每5mL RIPAlysis中加入50μL 100xPMSF既得；

(2)在沉淀中加入200-500μL裂解液，用洗净并预冷的匀浆杵在离心管中将沉淀研磨、重悬以裂解，将重悬液吸出至干净并预冷的1.5或2mL离心管中；