[发明专利]液相色谱串联质谱测定血液样本中B族维生素的方法

说明书

本发明提供一种同时检测血液样本中维生素含量的高效液相串联质谱测定方法，具体涉及到B族维生素含量的测定。本发明首次实现了应用高效液相串联质谱技术对血液样本中8种B族维生素同时检测的目的，减少了基质干扰，操作简便，灵敏度高，检测范围宽，检测成本低,能够有效监测人体内B族维生素的水平，对临床维生素合理补充提供了重要的指导意义。

技术领域

本发明属于生物分析的技术领域，具体涉及到一种液相色谱串联质谱同时测定血液样本中8种B族维生素的方法。

背景技术

B族维生素是一类水溶性维生素，他们协同作用调节机体新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统的功能调节，促进细胞生长和分裂，是体内新陈代谢的重要一环，参与关键的代谢活动，通常以辅酶形式存在。B族维生素也叫乙族维生素，是一组不同结构的化合物，主要包括维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素B9。

维生素B1又称硫胺素，由真菌、微生物和植物合成，动物和人类则只能从食物中获取，是碳水化合物代谢及能量代谢所必需的酶，硫胺素在维持脑内氧化代谢平衡方面，如脂质过氧化产物水平和谷胱甘肽还原酶活性方面发挥重要作用。

维生素B2又称核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。

维生素B6又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛、吡哆酸及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素维生素B6人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。

维生素B9，一般指叶酸。叶酸是一种水溶性维生素，参与遗传物质和蛋白质的代谢；影响动物繁殖性能；影响动物胰腺的分泌；促进动物的生长；提高机体免疫力。L-5-甲基四氢叶酸是血清中叶酸的主要存在形式，叶酸，需要由亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)还原5，l0-亚甲基四氢叶酸为L-5-甲基四氢叶酸。

目前，常用的B族维生素检测方法主要包括化学荧光法、微生物法、分光光度计法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等。微生物法具有良好的灵敏度，不过它的特异性不够，无法区分检测多种维生素，只能检测单一的维生素。荧光法和分光光度计法的灵敏度不够，无法在生物样本中B族维生素的检测中应用。免疫法检测不具有特异性，不能够识别其他维生素衍生物，结果重现性较差，难以满足临床检测需求。毛细管电泳法作为经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，因其具有高分离性能以及消耗试剂少等特点在药品中B族维生素含量测定中得到了广泛的应用，在保证高分离性能的前提下，较高的电压会导致谱带展宽，从而降低分离效率。因而其常规分析的灵敏度不能适应痕量组分分析的需求，这在一定程度上限制了它的应用与推广。高效液相色谱法由于色谱柱良好的分离作用，能够区分检测出多种维生素，中国专利文献CN104749266、CN107271588均采用该方法测定维生素功能饮料、复合维生素片及维生素营养强化米中多种水溶性维生素，但存在检测时间长、检测限高及生物基质较为复杂等问题，难以满足临床样品检测需求。在过去的十年中，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)被证明是一种越来越吸引人的技术。该方法具有高灵敏度、高分辨率、低检测限及重现性好等优点，广泛用于临床生物样品检测。

专利CN105424854公开了一种同时检测血液样品多种维生素的方法，检测的维生素主要包括：维生素B1、维生素B2、维生素B3(烟酰胺)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰钴胺)和维生素C，该方法维生素B2、B6及B12保留时间极为相近，难以实现分离，相应的维生素B3、B5及B7也难以在该方法中得到有效分离。L-5-甲基四氢叶酸作为血清中叶酸的主要活性代谢形式在该方案中没有得到分离与检测。此外，专利CN110133126公开了同时检测血样中5种维生素的检测方法，检测的项目主要包括：维生素B1、B2、B6(吡哆醇)、维生素B9(L-5-甲基四氢叶酸)维生素B12(氰钴胺)，该方法中维生素检测的线性范围较窄，难以满足血样样本的检测需求。