[发明专利]液相色谱串联质谱测定血液样本中B族维生素的方法

权利要求书

1.一种液相色谱串联质谱测定血液样本B族维生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)溶液的制备：

精密称量硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸、核黄素、叶酸、L-5-甲基四氢叶酸8种B族维生素，其中硫胺素、吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛、4-吡哆酸用0.1mol/L HCl溶液溶解，核黄素用0.2％醋酸水溶液(含1％抗坏血酸)溶解，叶酸用氢氧化钠的乙醇溶液(0.01mol/L；乙醇溶液(20％，v/v))溶解，L-5-甲基四氢叶酸用20mmol/L磷酸盐溶液(含1％抗坏血酸)溶解，定容稀释，得到8种B族维生素的储备液，浓度均为1mg/mL，然后用1％抗坏血酸水溶液将储备液逐级稀释，得到8种B族维生素的标准工作溶液；

用50％乙醇水溶液(含1％抗坏血酸)溶解内标化合物，得到¹³C₃-硫胺素、¹³C₄、¹⁵N₂-核黄素、D₃-吡哆醇、D₃-吡哆胺、D₃-吡哆醛、D₃-4-吡哆酸、¹³C₅-叶酸、¹³C₅-L-5-甲基四氢叶酸的储备液浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、8μg/mL、32μg/mL、32μg/mL、8μg/mL、40μg/mL、160μg/mL，然后将内标储备液用1％抗坏血酸乙腈溶液稀释，得到内标工作溶液；

(2)标准曲线的制备：

吸取步骤(1)制备的8种B族维生素的标准工作溶液200μL，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL 0.5％甲酸水溶液复溶，得到B族维生素的校正标样；将校正标样进行液相质谱分析，以各分析物与内标的峰面积比值为纵坐标，各分析物浓度为横坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行线性回归，得到各分析物的标准曲线；

(3)液相色谱串联质谱法检测：

液相色谱条件包括：色谱柱为ACE C18-PFP(2.1mm×150mm，3μm)，流动相A为0.5％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液；洗脱方式：洗脱梯度程序如下：0-2.6min 90％(v/v),2.9-6min 5％(v/v),6.5-7.0min 90％(v/v),分析时间为8min；柱温为40℃，进样体积为10μL，流速为0.2-0.4mL/min；

串联质谱条件包括：采用电喷雾离子源ESI，正离子模式扫描，选择反应监测模式，离子喷雾电压为5500v，离子源温度为650℃，气帘气压力：25psi，碰撞气流速为medium，离子源雾化气压力为50psi，离子源加热辅助气压力为50psi；

(4)待测血液样本的预处理：

精密吸取200μL血液样本置于2.0mL的离心管中，加入600μL内标工作溶液，涡旋混匀5min，14000rpm离心10min，取上清液700μL置于洁净的离心管内，室温氮气吹干，加入100μL0.5％甲酸水溶液复溶，得到待测血液样本；

(5)待测血液样本的检测：

将步骤(4)制备的待测血液样本进行液相质谱检测，将检测结果代入步骤(2)所得标准曲线，回算出血液样本中B族维生素的浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中8种B族维生素工作液的浓度范围：硫胺素为5-100ng/mL，核黄素为0.6-100ng/mL，吡哆醇为0.6-100ng/mL，吡哆胺为0.6-100ng/mL，吡哆醛为0.6-100ng/mL，4-吡哆酸为0.6-100ng/mL，叶酸为0.12-20ng/mL，L-5-甲基四氢叶酸为0.6-100ng/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液样本是血浆或血液。