[发明专利]克罗诺杆菌属内4个种的特异性新分子靶标及其快速检测方法

说明书

本发明公开了克罗诺杆菌属内4个种的特异性新分子靶标及其快速检测方法，本发明方法提供了用于鉴别克罗诺杆菌属内4个种——阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌的共19个新特异性分子检测靶标，以及对应的PCR引物组和PCR快速检测方法。本发明方法无需经过生理生化鉴别即可检测到克罗诺杆菌属的种水平，具有检测时间短、成本低、操作简单、特异性强的优点；并有效降低了出现假阳性或假阴性的几率，检测结果更准确，结果判定更简单，实用性更强，对克罗诺杆菌的鉴别具有重要的意义。

技术领域

本发明属于微生物检验技术领域，涉及鉴别克罗诺杆菌的方法，具体涉及克罗诺杆菌属内4个种的特异性新分子靶标及其快速检测方法。

背景技术

克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)，是一类重要的食源性致病菌，可导致各个年龄层人群发病，尤其对早产儿、低重儿和免疫低下的新生儿威胁较大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡，死亡率高达40-80％。由于其高危害性，国际食品微生物标准委员会于2002年将该菌列为对特定人群产生严重的生命危害、或产生慢性后遗症的微生物。

随着对克罗诺杆菌的深入研究和不断发展的现代分类技术，该菌的命名及类别分型经历了从种到属的变化。目前，克罗诺杆菌属包含7个种：阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacter turicensis)、莫金斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)、康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacter universalis)和都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)，其中阪崎克罗诺杆菌为该属的模式菌种。研究表明，属内7个种的毒性之间存在差异，并不是所有的种都与感染相关，只有阪崎克罗诺杆菌，丙二酸盐克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌可导致新生儿感染。十二五期间本研究团队首次系统完成了我国28个主要城市2717份食品中致病微生物风险调查，已分离保存了1092株克罗诺杆菌，总污染率高达17.96％，其中阪崎克罗诺杆菌占64.78％、丙二酸盐克罗诺杆菌占23.36％、苏黎世克罗诺杆菌占1.37％、都柏林克罗诺杆菌占10.13％、莫金斯克罗诺杆菌占0.36％。

克罗诺杆菌的检测方法主要有两大类型，分别是传统培养方法和分子生物学检测。传统培养方法可以分离到目标菌，但缺点是耗时长(5d以上)、操作繁琐(预增菌、选择性培养、显色培养、生化鉴别)、成本高，且准确性和特异性不高，容易出现假阳性或假阴性结果。以PCR为主的分子生物学检测方法以其快速、准确、简便的特点，逐渐成为取代传统检测方法最具潜力的检测技术之一。

目前国内外已报道的PCR方法主要检测对象为克罗诺杆菌属，用于检测克罗诺杆菌属内不同种的PCR方法还较为少见。Stoop等以rpoB基因为基础首次建立了能够同时检测克罗诺杆菌六个种的PCR检测方法，但检测C.sakazakii则需要两对引物，两次PCR反应。Carter等利用cgcA基因建立了检测不同克罗诺杆菌种的PCR方法，但是用于检测C.sakazakii的引物特异性相对较差，在琼脂糖凝胶上能够观察到非特异性片段。Huang等以gyrB基因为基础建立的PCR检测方法，能够有效区分C.sakazakii和C.dublinensis，但不能区分C.sakazakii和C.malonaticus。因此，系统性的挖掘克罗诺杆菌属种水平上的特异性新靶标，建立准确、快速的PCR检测方法，对于克诺杆菌的检测及污染调查研究具有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供用于鉴别克罗诺杆菌属内4个种，即阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacter turicensis)和都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)的特异性新分子靶标及相应的检测方法。