[发明专利]橘青霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法

说明书

本发明涉及一种橘青霉素检测卡的制备方法。本发明的检测卡外壳中的试纸条，由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水棉组成；胶体金膜为含橘青霉素单克隆抗体的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有T线和C线，T线包被有橘青霉素蛋白质偶联物，C线包被有兔抗鼠抗体。本发明有效用于快速检测橘青霉素，方便、快捷、结果准确。

技术领域

本发明涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域，特别是涉及橘青霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

橘青霉素是橘青霉等的毒性代谢产物，主要污染大米；橘青霉素为黄色结晶，熔点172℃；溶于稀碱性溶液及有机溶剂，难溶于水。是肾脏毒。对各种动物的LD50(mg/kg(体重))小鼠皮下和腹腔注射均为35，经口为110；大鼠皮下和腹腔均为67；家兔静脉为19；豚鼠皮下为37；橘青霉素和N-(3,5-二氯苯基)-琥珀酰亚胺结合可诱发大鼠肾肿瘤，有遗传毒性。

目前，现有技术对于橘青霉素的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这种技术需要的设备昂贵，操作复杂，难于推广。因此，建立一种适合简单、有效、适合基层使用的测定方法，是非常必要的。本发明就是希望研发出一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉、结果准确的检测方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种橘青霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出β-肾上腺素受体激动剂橘青霉素的问题。

本发明的技术方案是：一种橘青霉素胶体金检测卡，它是在长条扁平壳状的检测卡外壳6中设置试纸条5，检测卡外壳表面有加样孔1和检测孔4，试纸条是由PVC胶板9上依次固定样品垫7、胶体金膜8、包被膜10和吸水棉11所组成；PVC胶板9一段叠置粘贴吸水棉11，另一端叠置粘贴样品垫7，中部叠置粘贴包被膜10，包被膜10两端分别与样品垫7后端面和吸水棉11的前端面紧密搭接，在样品垫7与包被膜10的搭接部，两者之间夹置粘贴数段胶体金膜8；

胶体金膜为含橘青霉素单克隆抗体胶体金标记物的玻璃纤维素膜，包被膜是硝酸纤维素膜，其上设有一条包被有橘青霉素蛋白偶联物的检测线2和一条包被有兔抗鼠抗体的质控线3，试纸条5置入检测卡外壳6内，样品垫7正对加样孔1，包被膜10正对检测孔4。

本发明的橘青霉素胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇·2H₂O）溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的橘青霉素抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS 稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS 稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心20 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成橘青霉素单克隆抗体胶体金标记物；