[发明专利]一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，具体涉及动物模型的构建方法领域，所述具体步骤如下：斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物。本发明能够得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体，利用斑马鱼胚胎透明性与自主溶氧性，使得该突变体能够用于筛选验证不同心血管药物对心血管发育的影响，该斑马鱼动物模型的构建方法对心血管疾病治疗药物的筛选具有重要生理意义及特异性。

技术领域

本发明涉及动物模型的构建方法领域，特别涉及一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法。

背景技术

Heg1(heart of glass)基因是一种跨膜受体，2003年由John D.Mably在斑马鱼ENU筛选中鉴定出的一种胚胎隐性致死突变，具有心房心室特异性增大、血流迟滞的心血管疾病表型，Heg1主要调控心脏与血管细胞—细胞间的粘附性，在小鼠中研究显示heg1基因突变会导致内皮屏障减弱，引发败血症、动脉粥样硬化和多发性硬化等心血管疾病，在人类、小鼠和大鼠中均能检测到heg1的同源基因，这就使得heg1突变体中得到的实验数据应用于人类临床提供了可能性，

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9基因编辑技术是一种精确便捷的基因编辑方式，用于目标基因片段的定点插入、删除、激活，1987年，日本学者首次在Escherichia coli染色体上发现的了CRISPR，CRISPR/Cas9是一种由RNA引导的核酸内切酶，通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑，CRISPR序列在前导区的调控下，转录出RNA前体经一系列加工为的crRNA，同时转录出反式激活crRNA，与RNaseⅢ—同形成成熟的crRNA，其中crRNA和tracrRNA部分互补配对形成双链RNA，由于其作用是引导Cas9靶向切割DNA，随后gRNA和Cas9形成切割复合体，Cas9蛋白识别目的DNA的PAM位点，gRNA上的序列与基因组DNA序列进行碱基互补配对，随后，复合体上的Cas9蛋白将gRNA所识别的序列进行切割，造成DNA双链的断裂；RuvC则参与另一条链的切割，最终导致双键断裂，在DNA修复过程中，随机插入或缺失一部分碱基，产生移码突变或错误修复，从而完成对敲除靶基因的目的。

但是其在实际使用时，如在进行操作的过程中，难以得到得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，以斑马鱼心血管发育调控基因heg1为目的基因，利用CRISPR/Cas9技术，在野生型斑马鱼受精卵中显微注射体外设计合成的heg1特异性gRNA及Cas9蛋白，经过逐代筛选得到heg1基因特异性敲除斑马鱼突变体，观察突变体心血管表型并进行传代保育，本发明能够得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体，利用斑马鱼胚胎透明性与自主溶氧性，使得该突变体能够用于筛选验证不同心血管药物对心血管发育的影响，该斑马鱼动物模型的构建方法对心血管疾病治疗药物的筛选具有重要生理意义及特异性，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，所述具体步骤如下：

(2)(1)斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物，gRNA体外合成分为如下几步：

(1.2)首先以pMD19-T质粒与gRNA序列为模板，PCR扩增DNA序列，再用试剂盒进行gRNA链的合成；

(1.2)得到gRNA体外合成模板后可进行gRNA体外合成；