[发明专利]一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法

权利要求书

1.一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于，所述具体步骤如下：

(1)斑马鱼heg1基因gRNA靶位点的选择及gRNA体外合成：为得到目的靶点，首先在斑马鱼基因组数据库下载目的基因heg1的基因组数据，选取heg1基因第一外显子附近529bp长目的序列输入靶位点网站得到靶位点引物，gRNA体外合成分为如下几步：

(1.1)首先以pMD19-T质粒与gRNA序列为模板，PCR扩增DNA序列，再用试剂盒进行gRNA链的合成；

(1.2)得到gRNA体外合成模板后可进行gRNA体外合成；

(2)受精卵显微注射heg1 gRNA及Cas9蛋白，(2.1)注射前准备：配制注射板：用eggwater与琼脂糖粉末配制1.5％凝胶液，趁热将琼脂糖凝胶倒入Dish，利用注射槽模板制作凝胶注射板，冷却凝固；

(2.2)制作注射针：利用拉针仪将注射用毛细玻璃管加热拉开，一条毛细玻璃管得到注射用玻璃针，注射时根据需要量裁剪玻璃针细端，注入药品后用于注射；

(2.3)配成鱼：注射前一天晚上选择状态良好并且7天内未产卵的成鱼，每个交配盒中放一公一母两条鱼，中间用挡板隔开，注射时拔开挡板，5分钟内即可得到受精卵，每对鱼可产卵300颗；

(2.4)显微注射：注射当天早上准备注射试剂，吸取1μL Cas9蛋白混合液+1μL gRNA注入玻璃注射针，将注射针固定在注射仪上或直接手持注射针，通过注射以上调节旋钮调节液滴大小，注射量最大不超过1nl，拔掉挡板收集鱼卵，每收集300颗鱼卵进行一轮注射，将收集到的鱼卵放入加入egg water的培养皿，使用巴斯德管吸取鱼卵倒入注射皿，使用小号毛刷轻轻整理鱼卵排列整齐，正式注射，调整好角度，使液体注射入受精卵一细胞中或上升流位置，折射完成后用小号毛笔将鱼卵轻拨出凹槽，吸入新的egg water培养皿中，28.5℃恒温培养；

(3)测序鉴定gRNA是否工作，大量显微注射并饲养F0代斑马鱼：(3.1)注射完成后待受精卵发育到1.5天时，随机分别吸取15枚注射组胚胎与未注射对照组胚胎，将斑马鱼胚胎移PCR管中，根据样品量加入适量NP40裂解液，使用PCR仪加热裂解胚胎释放DNA，裂解程序为：55℃15小时,95℃20min,16℃forever，程序结束后取出，涡旋振荡仪迅速震荡混匀后掌中宝离心机瞬离十秒钟，组织样品裂解完成，4℃储存，此方法得到的DNA片段长度约1000bp，以此为模板使用靶序列上下游检测引物进行PCR测序；

(3.2)将注射后胚胎饲养至成鱼，称F0代，之后将其分别与野生型AB杂交，产生子代胚胎1.5dpf时采用上述方式裂解释放DNA，并用同种检测引物PCR测定基因型，子代测序结果在靶序列附近仍会出现套峰，F0就是需要的突变体；

(4)鉴定F0代斑马鱼heg1基因突变情况及突变体保育：此时能够在测序结果中读出此F0碱基突变情况为缺失25个碱基，将F0与野生型杂交，产生子代F1饲养至成鱼，拔取F1鳞片释放DNA，PCR扩增目的条带检测验证碱基突变，选取F1中稳定遗传的杂合子继续进行传代饲养，并用于以后实验；

(5)heg1心血管疾病模型表型分析：每个交配盒中放一公一母两条heg1杂合子成鱼，中间用挡板隔开，第二天拔掉挡板收集受精卵，将受精卵放入egg water于28.5℃恒温培养，在胚胎发育到第2、3、4天时分别进行表型观察，通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、心率测量、心血管发育相关基因的表达三方面评价突变体特征，对斑马鱼血管疾病药物筛选模型有效性进行验证；

(5.1)心血管形态观察：在凹槽玻片上滴一滴3％甲基纤维素，将斑马鱼胚胎脱膜或剥膜后用吸管吸取斑马鱼，竖直放置待斑马鱼下沉到管口，轻轻挤压稍许将其滴到甲基纤维素表面，用小号毛笔拨动斑马鱼，调整其姿势使适合观察，侧面拍照，使两侧眼、体节重合，尾部和身体处于同一水平面，斑马鱼位置摆好后，在白光镜下可观察到突变体胚胎有明显的心血管畸形，2dpf(受精后2天)突变体心房明显膨大，且能够观察到心脏内明显血液淤积，心脏畸形在接下来的发育中越来越明显，3dpf突变体心房心室膨大，且心脏与背部静脉均可见大量血细胞淤积，4dpf血流淤积与心房心室膨大表型更为严重；

(5.2)心率测量：在测量斑马鱼心率前，将其放置在室温，适应环境温度15min以上，将斑马鱼胚胎置于凹槽玻片上，滴入1×(0.16mg/ml)MS-222将斑马鱼麻醉，用发圈拨动斑马鱼胚胎，使其呈侧卧状态，使两侧眼、体节重合，尾部与身体处于同一水平面，位置摆好后，在体视显微镜下观察，心跳清晰可见，使用手工计数器及计时器记录正常斑马鱼胚胎及突变体胚胎一分钟内心跳数，每条胚胎重复三次，每组重复5个胚胎以上，结果显示心血管疾病模型与野生型相比心率明显较低；

(5.3)静脉窦-动脉球间距测量：静脉窦是血液进入心房的部位，动脉球是血液流出心室的部位，正常发育过程中斑马鱼心脏经向右环化使得心房、心室在侧面观上部分重叠，心室在心房的右前侧，若心脏发育过程受到影响，心房和心室的位置将发生改变，静脉窦和动脉球之间的距离相应发生改变，两者之间的距离是心脏环化程度的指标，通过测量静脉窦与动脉球之间的距离可量化药物对斑马鱼心脏影响程度，在体视显微镜下，通过目镜测微尺测量两者间距离，换算成实际长度，结果显示心血管疾病模型与野生型相比其静脉窦和动脉球距离明显较大；

(6)突变体作为心血管疾病药物筛选动物模型的应用：收取受精时间为4h的斑马鱼卵，将血塞通分散片按照200mg/l药物浓度将心血管基因敲除鱼系在2dpf进行药物暴露，斑马鱼心血管系统形态学观察、心率测量、心血管发育相关基因的表达三方面评价突变体特征，对斑马鱼血管疾病药物筛选模型有效性进行验证，与野生型胚胎相比，心血管药筛模型表现出明显的血流阻塞、血细胞堆积于心房心室，使用血塞通分散片处理后，疾病模型心血管表型得到明显缓解，表现为血流缓慢、血细胞于心房心室堆积较少，心率测量实验及静脉窦-动脉球间距测量均证明血塞通分散片处理后疾病模型心率也有所恢复。