[发明专利]一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法

说明书

本发明公开了一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法，属于生物技术领域。该诱导方法包括以下步骤：首先，对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS液体培养基中进行培养，得到红车轴草无菌苗；将上述红车轴草无菌苗作为侵染材料，并将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；接着，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中进行共培养处理后，再转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中进行抑菌培养处理，即可得到诱导转化的毛状根。本发明通过筛选合适的外植体与改良菌液侵染方式，同时，通过控制乙酰丁香酮和头孢噻肟钠添加浓度，以及控制共培养时间，可以大大提高毛状根的诱导转化率和成活率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种红车轴草毛状根的诱导及增殖方法。

背景技术

红车轴草异黄酮类化合物是其重要的次生代谢活性成分，具有多种重要的药理功效，

具有较高的医用价值。尽管栽培红车轴草资源丰富，但其生长周期长，活性成分含量易受环境变化与病虫害等因素的影响，易造成药材产量与质量的下降的问题。相比之下，毛状根培养体系具有遗传稳定、生长迅速、安全可靠、异黄酮次生代谢产物合成能力高以及规模化生产等特点。因此，目前亟待研究一种红车轴草毛状根的诱导以及对高产异黄酮毛状根体系进行系统优化的方法。

另外，虽然在现有技术中，发根农杆菌可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，通过发根农杆菌感染植物，可以诱导产生毛状根；但是，现有技术还未成功利用发根农杆菌对红车轴草进行高效诱导以及对该毛状根体系的液体培养体系进行系统优化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红车轴草毛状根的诱导方法及增殖方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种红车轴草毛状根的诱导方法，包括以下步骤：

(1)对红车轴草种子进行消毒和清洗处理后，再将红车轴草种子置于MS(Murashige/Skoog，MS)液体培养基中进行培养7～14天，得到红车轴草无菌苗；

(2)先取整株红车轴草无菌苗作为侵染材料；接着，将发根农杆菌侵染液注射到侵染材料中；然后，将注射有发根农杆菌侵染液的侵染材料接种于含有乙酰丁香酮的MS培养基中进行共培养处理；所述含有乙酰丁香酮的MS培养基中乙酰丁香酮的质量浓度为80～120mg/L；

(3)将上述共培养处理后的侵染材料取出，并转移到含有头孢噻肟钠的MS培养基中进行抑菌培养处理，得到诱导转化的毛状根；所述含有头孢噻肟钠的MS培养基中头孢噻肟钠的质量浓度为450～550mg/L。

本发明实施例提供的一种优选方案，所述发根农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：先将发根农杆菌接种于含有氨苄青霉素的酵母甘露醇肉汤(Yeast Mannitol Broth，YEB)固体培养基中进行暗培养，形成单菌落；接着，将单菌落接种于含有氨苄青霉素的YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD₆₀₀值为0.6～1，得到活化菌液；然后，将活化菌液接种于新鲜YEB液体培养基中进行摇床振荡培养至OD₆₀₀值为0.5～1，得到所述的发根农杆菌侵染液。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(1)中，消毒处理的方法包括以下步骤：先用乙醇溶液对红车轴草种子进行初步消毒；接着，将初步消毒后的红车轴草种子用无菌水进行清洗；然后，将清洗后的红车轴草种子用氯化汞溶液进行再次消毒。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述乙醇溶液中乙醇的体积分数为75％～90％。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述氯化汞溶液中氯化汞的质量百分比浓度为0.1％～0.3％。

本发明实施例提供的另一种优选方案，所述的步骤(2)中，共培养处理的时间为36～72h。