[发明专利]PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法，本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，包括引物和标准品，所述的引物为上游引物与下游引物。所述的上游引物具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；所述的下游引物具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列；上游引物设计于禽腺病毒基因组ITR基因序列10bp～50bp区间，下游引物设计于ORF0基因序列546bp～606bp区间。本发明操作便捷，适合于检测大量样本，可以快速，高度灵敏、特异、快速检测的禽腺病毒血清4型。为禽腺病毒血清4型爆发时的快速、准确地诊断大批临床样品，并尽快地控制本病提供了技术手段。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。

背景技术

鸡的包涵体肝炎和心包积液综合征均是由禽腺病毒属病毒引起的急性传染病，1963年美国首次在肉鸡中首次发现包涵体肝炎，1987年巴基斯坦在肉鸡中首次发现心包积液综合征，该病以心包积液，肝脏肿大、发黄、出血、脂肪沉积和肾脏尿酸盐沉积萎主要特征，因此也被称为心包积液-肝炎综合征。1976年和1999年我国已有包涵体肝炎和心包积液综合征相关报道，2012年心包积液综合征在我国开始流行，给养鸡业造成重大经济损失。

禽腺病毒属于腺病毒科、禽腺病毒属，病毒粒子呈球形，无囊膜，直径为80～100nm呈二十面体对称，基因组为双链DNA。感染鸡的禽腺病毒主要是血清1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型，共12类不同血清型。流行病学调查显示，在我国流行的禽腺病毒血清型包括1、2、3、4、8a、8b、11型，而禽腺病毒中以血清4型致病性最为严重，是心包积水综合征最常见的病原。该病主要在亚洲和美洲报道较多，以肉鸡多发，死亡率在20％～80％，给养禽业造成巨大经济损失。

目前禽腺病毒的血清4型鉴定中通常采用方法有：血清交叉中和试验、序列比对分析、限制性内切酶鉴定。

(1)血清交叉中和试验

该方法需要将腺病毒毒株稀释至200TCID₅₀与不同血清型禽腺病毒标准阳性血清进行中和试验检测，比较不同血清型的阳性血清对毒株的中和效价，当中和效价相差16倍或者与其他阳性血清不发生中和作用，确定血清型；当中和效价相差8或16倍，以血凝抑制试验与其他血清型没有交叉反应，或与其他血清型存在理化性质及系统发生的显著差别时，也可确定为新的血清型。该方法是血清型鉴定的标准操作方法，也是被业内所认同，但是该方法也存在以下缺点：标准血清获取困难、操作技术要求高、检测周期长。

(2)序列比对分析

该方法以禽腺病毒的保守基因(Hexon、penton、fiber)为靶基因，设计相关引物扩增测序获得基因序列，通过与标准毒株序列进行比对，依据检测基因与标准毒株基因相似性确定血清型。该方法中由于腺病毒保守基因同源性高，设计引物特异性差，除目的血清型腺病毒，仍可扩增出其他血清型禽腺病毒。该方法与交叉中和试验相比，仍具有快速、廉价、操作简便等特征，但是存在检测周期长、特异性差等缺点。

(3)限制性内切酶鉴定

该方法通过不同限制性内切酶对禽腺病毒基因组或者PCR扩增保守基因进行酶切，分析比较检测毒株与标准毒株的酶切图谱，以确定检测毒株的血清型，该方法具有快速、廉价等优点，但是存在标准毒株基因组获取困难、检测周期长、敏感性差等缺点。

目前，缺少一种高灵敏度的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。

发明内容

本发明目的是提供一种高灵敏度的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案如下：本发明的一种PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒，其特征在于：所述的PCR检测和分型禽腺病毒血清4型的试剂盒包括引物和标准品，所述的引物为上游引物和下游引物，