[发明专利]一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法

说明书

本发明涉及一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法，属于生物工程技术领域。本发明利用含高渗盐的培养基培养带荚膜细菌，以得到感受态细胞，再利用电击转化方法使外源DNA或转座复合体进入带荚膜细菌的细胞内，提高带荚膜细菌的遗传转化效率，获得转化子或突变株。与现有技术相比，本发明通过适当提高普通LB培养基中的NaCl浓度来达到提高转化效率的目的。实验结果表明，这种处理能有效提高转座突变株得率，是一种性价比高、简单有效的处理方法，在具荚膜细菌的遗传转化和基因工程操作中将有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法。

背景技术

非豆科植物来源的固氮菌(如联合固氮菌)的应用开发是近年来微生物固氮领域的研究热点，国内外研究者从水稻、草坪草、小麦等植物中分离鉴定了许多固氮菌株，其中一些固氮菌对农作物还有明显的促进生长作用，在农业生产及农田生态系统的保护方面显示了良好的应用前景。由于固氮菌能固定空气中的氮气，并转化成氨，可以增加土壤中的氮素含量，提高肥力，减少对化学氮肥的依赖，减轻甚至消除由于过量施用化学氮肥而造成的土壤盐碱化、水体富营养化等环境污染危害。为了能更好地利用固氮菌，将之开发成菌肥或生物菌剂，需要采用遗传转化等方法进行定向改造。由于一些固氮菌外被很厚的荚膜，这造成了遗传转化的很大困难。应用质粒采用通常的化学转化法(氯化钙热击转化法)对这类菌来说根本无效，只能采用电击转化的方法来进行遗传改造，比如转座插入突变、同源重组基因敲除等。如何减少荚膜的产生，增加细菌细胞和外源遗传物质的接触机会，提高转化率或突变率是固氮菌基因工程领域的一个难题。联合固氮菌GXGL-4A分离自玉米，该菌为兼性厌氧菌，有着很好的固氮活性，对玉米、黄瓜和水稻的生长都有着很好的促进作用，但是该菌细胞外被一层较厚的荚膜紧紧覆盖，遗传转化十分困难。采用传统的细菌结合转移、氯化钙化学转化法等均难以实现质粒转化，进行遗传突变株的构建更为困难，转化率很低，难以制备大量的突变体，这限制了此菌在农业上的开发利用。因此，从抑制荚膜生成，消除转化过程中这一物理障碍，提高细菌的转化效率十分必要，这方面的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种提高带荚膜细菌(如固氮菌GXGL-4A)的遗传转化率的方法。

采用本发明的方法可以很方便地获得大量转化子。这种方法适用于所有同样带有厚荚膜的其他细菌，方便进行质粒转化、Tn5转座插入突变、转座复合体的电击转化等，简单有效。本发明的方法也适用于快速构建带荚膜细菌的突变体库，在短时间内获得大量突变株。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明首先提供一种制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，利用含高渗盐的培养基培养带荚膜细菌，以得到感受态细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述带荚膜细菌包括固氮菌，所述固氮菌包括固氮菌GXGL-4A。

在本发明的一个实施方式中，所述含高渗盐的培养基指含有15g/L NaCl的培养基。

本发明通过适当提高LB培养基中的NaCl浓度，创造一定的渗透势，在此胁迫逆境下细菌细胞被迫失水，荚膜结构将遭到一定的破坏，变得更加蓬松，甚至部分脱落，粘多糖层厚薄不一，在荚膜较窄的区域或者有裂隙的部位遗传物质更易通过荚膜层进入胞内，以完成遗传转化或同源重组突变、转座插入突变等过程，提高了转化效率。如图1所示。

在本发明的一个实施方式中，制备带荚膜细菌感受态细胞的方法，具体包括以下步骤：

A、普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌，

B、再以1-2％接种量接种于含高渗盐的培养基中培养到对数前期，

C、低温下离心收集细菌沉淀，PEB电击缓冲液洗去杂质和菌体碎片，得到细菌感受态细胞。