[发明专利]反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法、引物和试剂盒

说明书

本申请涉及一种反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法、引物和试剂盒，通过使用序列为：nirK_F：GGCGACTATGTCTGGGAGA，nirK_R：CGATCAGGTTATGGTTGACG的引物取得了扩增产物单一，CT值区间合理，nirK基因扩增数量多的优点。

技术领域

本申请属于物检测技术领域，尤其是涉及一种反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法、引物和试剂盒。

背景技术

亚硝酸盐还原酶(Nir)参与反硝化反应过程中NO₃→NO₂→NO→N₂O→N₂中NO₂→NO的转化。亚硝酸盐还原酶是该反应的限速酶。亚硝酸盐还原酶也是反硝化细菌研究最多的功能基因，亚硝酸盐还原酶主要包括Cu型亚硝酸盐还原酶nirK和细胞色素型亚硝酸盐还原酶nirS。

土壤中氮含量是影响土壤中反硝化细菌的一个重要因素，氮肥的使用会明显改变nirK型反硝化细菌生物群落的组成，nirK型反硝化细菌对土壤硝酸盐，PH值，有机质等具有一定的敏感性。

土壤中Nir型反硝化细菌的检验方法主要有：土壤酶活性分析，同位素示踪，Biolog微平板分析，微生物平板纯化培养，PLFA图谱分析，荧光标记蛋白，荧光染色，荧光原位杂交，RFLP分析，荧光定量PCR分析。

荧光定量PCR分析的优点主要表现在操作方便，速度快，精确度高等，但是目前的用于nirK定量PCR检测的引物(F：GGMATGGTKCCSTGGCA和R：GCCTCGATCAGRTTRTGG)存在较多的兼并碱基，且扩增产物长度达到515bp，兼并碱基和扩增产物长度均会影响引物的扩增效率，扩增效率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中的不足，从而提供一种高效扩增反硝化细菌nirK基因绝对定量检测引物和试剂盒，并同时提供一种反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高效扩增反硝化细菌nirK基因绝对定量检测引物，所述引物的序列为：

nirK_F：GGCGACTATGTCTGGGAGA

nirK_R：CGATCAGGTTATGGTTGACG。

本发明还提供一种反硝化细菌nirK基因绝对定量检测试剂盒，包括上述的检测引物。

本发明还提供一种高效扩增反硝化细菌nirK基因绝对定量检测引物在检验土壤中反硝化细菌Cu型亚硝酸盐还原酶的应用。

本发明还提供一种反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法，包括以下步骤：

对反硝化细菌的nirK基因进行DNA的提取，获得待检样品；

使用权利要求1所述的引物对待检样品进行PCR扩增反应；

对PCR扩增产物进行检测。

优选地，本发明的反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法，定量PCR扩增反应体系为：

qPCRMix：10ul，

Primer_F+R：2ul，

DNA模板：8ul。

优选地，本发明的反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法，反硝化细菌来自土壤。

优选地，本发明的反硝化细菌nirK基因绝对定量检测方法，采用天根土壤基因组DNA提取试剂盒提取DNA。