[发明专利]一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物中活性组分的应用

说明书

本发明公开了一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱及其在筛选天然产物中活性组分的应用。所述的基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱的制备方法为：将介孔氧化硅材料与α‑葡萄糖苷酶溶液，谷胱甘肽溶液，乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌反应，得到负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料；将大豆卵磷脂与胆固醇充分溶于氯仿中得到混合液；将所得负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料浸渍于所得混合液中，减压蒸除有机溶剂，负载α‑葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料表面即形成一层磷脂膜，然后洗涤、干燥得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相湿法装柱，得到基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱。本发明所述的基于靶点蛋白的受体生物膜色谱柱应用于筛选天然产物活性组分。

技术领域

本发明涉及一种用于筛选天然产物中活性成分的方法，尤其涉及一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱从而筛选天然产物中活性成分的方法。

背景技术

药物筛选是指利用适当的筛选方法和技术，建立合适的筛选模型，从可能作为药物使用的天然或合成化合物中得到高效的先导化合物，对其进行药理及药效活性的检测，药用价值的评估，评价某一化合物的药用前景的方法，是新药研发中缩短时间、减少成本、降低风险的关键步骤。

如今的药物筛选方法主要包括整体动物水平筛选、细胞水平药物筛选、分子水平药物筛选，而由于动物水平筛选价格昂贵，病理部位和药物作用机制不明，细胞水平筛选技术要求较高，细胞易失活的缺点，分子水平药物筛选模型逐渐成为使用范围最广，技术最成熟的筛选方法之一。

基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱筛选方法即为分子水平药物筛选的一种。色谱方法应用于α-葡萄糖苷酶活性成分筛选主要还包括细胞膜色谱法，脂质体色谱法，受体色谱法。受体色谱的受体蛋白固定化存在活性损失及蛋白流失的问题，细胞膜色谱的色谱柱寿命较短，其细胞膜蛋白易脱落或失去活性，稳定性和重现性差。普通的脂质体膜中缺少必要的受体，既无法全面模拟药物在膜上的保留行为，也无法特异性筛选与受体结合的先导化合物。

现有的筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的色谱方法中，细胞膜色谱法细胞膜剥除困难，并且活性随时间衰减极快，无法重复利用。脂质体色谱法脂质体表面缺少受体，无法研究药物与膜及受体之间的作用研究药物与膜及受体之间的作用。细胞和动物水平筛选周期长、价格昂贵。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱，将生物膜色谱法与受体色谱法结合，以介孔材料冰浴搅拌负载受体，磷脂膜包覆使其不易脱落，再结合HPLC，结合了两者的优势，既可以研究药物与膜及受体之间的作用，排除非作用杂质成分的干扰，又可以多次重复利用，且制备工艺简单。

本发明采用的技术方案是：

一种基于靶点蛋白的介孔生物膜色谱柱按照如下方法进行制备：

(1)将介孔氧化硅材料与浓度为6.5～10万U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，1mg/mL谷胱甘肽溶液，2.5mmol/L的乙酸钠缓冲液混合，冰浴下搅拌反应为2～7h，得到反应混合物过滤，室温下真空干燥，得到负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料；所述的α-葡萄糖苷酶溶液与谷胱甘肽溶液、乙酸钠缓冲液的体积比为1:1:20～30；所述的乙酸钠缓冲液的pH值为3～5；

(2)将大豆卵磷脂与胆固醇充分溶于氯仿中得到混合液；所述的大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为1～5:1；

(3)将步骤(1)所得负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料浸渍于步骤(2)所得混合液中，常温下减压旋转缓慢蒸发除去有机溶剂，负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料表面即形成一层磷脂膜；

(4)将步骤(3)得到的覆盖有磷脂膜的负载α-葡萄糖苷酶受体的介孔氧化硅材料用纯水洗涤，除去未固定的磷脂膜和酶，真空干燥箱内常温干燥除去水分和剩余有机溶剂，得到覆盖有磷脂膜的介孔固定相；