[发明专利]一种胰高血糖素的制备方法

说明书

本发明涉及一种固相片段法制备胰高血糖素的方法。本发按照序列利用固相合成法逐个连接5‑29片段，然后将四肽片段Fmoc‑His(Trt)‑Ser(tBu)‑Gln(Trt)‑Gly‑OH连接至5‑29片段肽树脂上，酸解脱除保护基及切肽得到胰高血糖素粗品，经纯化、冻干后得到胰高血糖素纯品。本发明具有易于合成、杂质含量少且节约成本的优点。

技术领域

本发明涉及多肽药物制备领域，尤其是涉及一种固相片段法制备胰高血糖素的方法。

背景技术

胰高血糖素(glucagon)是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，它是由29个氨基酸组成的直链多肽，亦称胰增血糖素或抗胰岛素或胰岛素B，与胰岛素相对抗，起着增加血糖的作用，1953年，胰高血糖素被分离沉淀而取得结晶。其化学结构为H-His¹-Ser²-Gln³-Gly⁴-Thr⁵-Phe⁶-Thr⁷-Ser⁸-Asp⁹-Tyr¹⁰-Ser¹¹-Lys¹²-Tyr¹³-Leu¹⁴-Asp¹⁵-Ser¹⁶-Arg¹⁷-Arg¹⁸-Ala¹⁹-Gln²⁰-Asp²¹-Phe²²-Val²³-Gln²⁴-Trp²⁵-Leu²⁶-Met²⁷-Asn²⁸-Thr²⁹-OH，分子量为3485道尔顿。

胰高血糖素是一种比较难制备的29肽，特别是在N端末端几个氨基酸的连接中。迄今为止报道制备胰高血糖素的篇幅很少。专利CN1063795C报道了首先制备胰高血糖素融合蛋白，然后用酶处理并回收以生产胰高血糖素的方法。专利CN103333239B报道了一种胰高血糖素的固相合成方法，该方法以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法在较高温度下依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸或多肽，在连接过程中，使用了伪脯氨酸保护二肽进行氨基酸缩合。该专利采用高温技术方案的原因，在于解决合成速度慢、反应时间长的问题，从而更加适合工业化生产。然而在较高温度下的反应，及其可能会引起多肽合成中副反应的大量增加。所以该专利进一步采用了伪脯氨酸保护二肽的技术方案，以期减少副反应。但是，伪脯氨酸保护二肽作为一种特殊氨基酸，价格较普通氨基酸昂贵，对于多肽合成当中的成本控制不利，不利于规模化生产。

而且，N端末端几个氨基酸的连接中，由于连接难度的增加，每一个氨基酸的固相合成过程，都会增加副反应，而且与接近末端，副反应越多，这每一个步骤的副反应会步步累积，这样的结果，造成了最终产物纯度低。从另外一个角度来说，末端几个氨基酸连接的难度也很高，而且越接近末端越高，该专利为代表的现有技术没有解决这些问题。

发明内容

有鉴于此，开发一种易于合成、杂质含量少且节约成本的胰高血糖素制备方法十分必要。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种胰高血糖素的制备方法，包括：

步骤1)按照序列利用固相合成法逐个连接5-29片段，得到H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Wang树脂。